最受關(guān)注的基因編輯技術(shù)是什么？CRISPR！其中走得最快的系統(tǒng)是哪個？CRISPR/Cas9！

近幾年來，科學家不斷對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行改造，更敏感的檢測方法、更高效的Cas9酶、更好的遞送方式……與臨床之間的天塹鴻溝——脫靶效應(yīng)，在研究者的努力下已經(jīng)變得不那么可怕，使用CRISPR/Cas9進行的第一批臨床試驗也提上了日程。

稍等，CRISPR/Cas9真的如我們所想的那樣安全嗎？繼上個月的致癌疑云之后，本周《自然生物技術(shù)》又曝新問題，由CRISPR/Cas9介導的DNA雙鏈斷裂修復，極有可能造成切割位點遠端DNA大片段丟失、乃至其他更為復雜的基因突變[1]！

這種負面影響，一是丟失片段很長，可高達數(shù)千bp，可能影響細胞功能；一是距離切割位點較遠，可以位于20kb之外，正常評估流程難以檢測；一是隨機性強，每個樣本編輯后的基因型都有所不同，潛在影響的多樣化巨大！

該項研究來自英國惠康桑格研究所，人類基因組計劃中貢獻最大的科研機構(gòu)。文章通訊作者則是著名遺傳學家AllanBradley教授，他致力于癌癥與基因的研究，他擔任研究所長期間重新調(diào)整了惠康桑格研究所的發(fā)展方向，研究所名下的十數(shù)個生物信息學數(shù)據(jù)庫少不了他的功勞。[2]

一般來說，科學家認為Cas9導致的DNA修復不會造成20bp以上基因的插入和缺失[3-5]，不過實際上確實有研究曾發(fā)現(xiàn)，單gRNA誘導能夠在小鼠受精卵中造成600bp以上的基因缺失[6]，同時，雙gRNA誘導也表現(xiàn)出了比預(yù)期更加復雜的基因型改變[7]。

而且，在大多數(shù)研究中，對基因編輯結(jié)果的分析，往往只關(guān)注靶點和潛在脫靶位點周圍很小一段區(qū)域（<1kb），這樣很可能會錯過一些并不連續(xù)的突變位點。再者，研究所使用的細胞往往來自癌細胞系，其基因組和DNA修復機制本來就不正常，結(jié)果是否能夠推廣到正常組織和細胞上也是個未知數(shù)。

Bradley教授和同事們認為，可能有大量的編輯錯誤我們并沒有發(fā)現(xiàn)，如果這些異?；蛭挥谡诨钴S增殖的細胞中，那么很有可能會導致其他疾病。

為了搞清楚這個問題，研究者嘗試用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯雄性小鼠胚胎干細胞中的PigA基因。這個基因位于X染色體上，所以在XY細胞中沒有等位基因。

研究者首先嘗試了靶向基因外顯子的單gRNA，編輯效率還是很高的，59-97%的細胞PigA基因都喪失了功能。

然而奇怪的是，靶向內(nèi)含子的單gRNA也能夠?qū)е翽igA基因失活。要知道這些靶點距離外顯子還挺遠，263-520bp之間的10個不同靶點編輯效率有8-20%，還有兩個靶點距離外顯子2kb開外，居然也能導致5-7%的PigA失活！

為了搞清楚這過程中發(fā)生了什么，研究者對PigA缺陷細胞進行了大規(guī)模測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向內(nèi)含子的編輯，居然也會造成外顯子的缺失！也就是說CRISPR會造成意料之外的遠端DNA缺失！

研究者又繼續(xù)分離這些細胞挨個分析，發(fā)現(xiàn)將近四分之三的細胞（69/93）在切割位點和外顯子部分存在基因缺失，大小各不相同，最大能達到9.5kb；剩下的細胞則同時還有大片段插入等復雜的問題。

值得注意的是，這些“病變”與目標靶點并不相鄰，如果用通常的檢測方法，是根本無法發(fā)現(xiàn)的。

研究者還嘗試了從兩端同時擴增來自部分缺陷細胞的PigA基因，結(jié)果只能得到兩端的序列，得不到中間部分。進一步分析也顯示，存在著基因易位、倒錯這樣更為嚴重的結(jié)構(gòu)變異。

此外，細胞與細胞之間的基因缺失狀況又各有不同，這意味著潛在的致病模式多得無法想象。

鑒于實驗中PigA是單等位基因，考慮到可能具有特殊性，研究者又選取了另一種基因Cd9，這種基因位于常染色體上，并不是胚胎干細胞生存必須的基因，它的表達產(chǎn)物也很容易被染色檢測。

重復以上實驗，結(jié)果顯示靶向外顯子的gRNA編輯效率達到88%，而靶向內(nèi)含子的編輯效率則在2.6-3.8%之間?？紤]到破壞兩個等位基因才能夠阻止Cd9表達，這個結(jié)果實際上和PigA得到的基本一致。

測序結(jié)果也顯示，Cd9基因中存在大片段缺失，最長達到5.5kb，而且27個Cd9缺陷細胞中，只有一個具有完整的外顯子。

那么是不是由于小鼠胚胎干細胞尚未分化，具有某些特性，所以才造成這些問題的呢？同樣的實驗又在永生化人女性視網(wǎng)膜色素上皮細胞系（RPE1）和小鼠造血祖細胞中進行，結(jié)果也很相似。

轉(zhuǎn)染方式也并非關(guān)鍵，無論是PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，還是電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，CRISPR/Cas9造成的這種大片段缺失都是存在的。

本項研究中使用了小鼠的胚胎干細胞、造血祖細胞和人成熟分化細胞，前兩者具有正常的DNA修復機制，而這三者都在臨床研究中有著應(yīng)用。

考慮到臨床，事情就更加嚴肅了。臨床中往往要一次性編輯數(shù)十億個細胞，產(chǎn)生的大量不同突變很可能是致病的病變，乃至救命的細胞變成的致命的腫瘤。

Bradley教授表示，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的風險“被嚴重低估了”，而本項研究“應(yīng)當成為一記警鐘。”

這篇論文剛剛發(fā)表二十分鐘，業(yè)界領(lǐng)頭的CRISPR先驅(qū)們股價大跌，CRISPRTherapeutics股價下跌8.6%，EditasMedicine下跌7%，IntelliaTherapeutics下跌近10%。超過3億美元市值憑空蒸發(fā)。[8]

不過這些新貴們倒并不慌張，畢竟如果基因編輯真的會造成如此嚴重的后果，那么在鋅指或TALENs技術(shù)中也應(yīng)當有體現(xiàn)——很顯然，并沒有人觀察到。

Intellia表示，他們一直在對小鼠編輯后基因組進行分析，目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)任何“致癌”的突變。其副總裁TomBarnes表示，這可能是由于Bradley團隊采用了積極增殖的細胞，而Intellia使用的細胞更為“靜止”[9]。

Editas則發(fā)布聲明表示，公司致力于基于CRISPR的藥物，并不會受到這項研究的影響。

現(xiàn)在的問題和我們上個月討論的很類似了，如果這個現(xiàn)象是真的，那么我們?yōu)槭裁丛诖饲暗呐R床前實驗中從未觀察到小鼠大規(guī)模爆發(fā)腫瘤呢？

至少目前可以確定，體外編輯細胞之后，做個全基因組測序恐怕很有必要。