2003年的一個悶熱的下午，正在度假的西班牙微生物學家FranciscoMojica告訴他的妻子，他不打算回家了。多年來，Mojica一直在從事CRISPR研究，引導(dǎo)他進入這個研究領(lǐng)域的是一次偶然的發(fā)現(xiàn)：一個神秘的細菌DNA片段被插入了其他病毒的序列。
這個不歸家的下午，后來成就了超過2000篇的文章，其中包括《Nature》、《Science》、《Cell》等頂級期刊的發(fā)表的文章。
Mojica博士和同事們偶然發(fā)現(xiàn)了一種古老的細菌性免疫防御系統(tǒng)，可以儲存病毒的基因密碼，如果將該系統(tǒng)比作警察，那它手里就有罪犯——病毒DNA的照片，那么任何之前侵略過該細菌的病毒會被立馬清除出去。
這一發(fā)現(xiàn)可不可以被用于編輯其他基因呢？可以。
2012年，EmmanuelleCharpentier博士（柏林感染生物學Max普朗克協(xié)會的成員）和JenniferDoudna博士（伯克利大學霍華德休斯醫(yī)學研究所的教授）的合作，證明了CRISPR系統(tǒng)（使用一種名為Cas9核酸酶）作為一種有效的基因編輯工具，能夠定位和切割幾乎任何DNA序列。
現(xiàn)在張鋒博士和GeorgeChurch博士如果能夠證明CRISPR/Cas9可以編輯人體內(nèi)的基因，那么生物技術(shù)的革命暴風雨，將瞬間席卷全世界。
在過去的6個月中，我們看到了人類胚胎致病基因編輯的重大進展，包括基因編輯工具的拓展：RNA編輯器、CRISPR系統(tǒng)和超精密的基礎(chǔ)編輯系統(tǒng)。
那么在2017年，有哪些巔峰的CRISPR編輯系統(tǒng)的進展，值得我們在這一年的年尾反復(fù)回味呢？
1.MaloryeAllisonBranca——CRISPR系統(tǒng)將改變臨床的格局
2017年2月份，《Nature》子刊指出CRISPR編輯與測序技術(shù)相結(jié)合，可以大大提升
遺傳篩查的效率。
3月份，《Nature》發(fā)表斯隆凱特林癌癥紀念中心的論文，利用CRISPR編輯構(gòu)建強效CAR-T細胞研究論文，實現(xiàn)腫瘤的超強殺滅效果。
而如果說起基因編輯技術(shù)，就不得不提中國。2016年10月四川大學的LuYou教授第一個進行了CRISPR實驗，他在肺癌患者的肺中注入能夠降低PD-1活性的免疫細胞。雖然實驗結(jié)果有效性被頗多人質(zhì)疑，但是毫無疑問，這是一項創(chuàng)舉。
CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1是目前廣泛使用的基因編輯系統(tǒng)。目前來看，CRISPR臨床前研究的結(jié)果振奮人心，例如血友病、杜氏營養(yǎng)不良癥、眼部疾病或是甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性的治療。
隨著CRISPR基因編輯的技術(shù)發(fā)展，其應(yīng)用于臨床的前景必將無比寬闊。
2.DeeAnnVisk博士——基因編輯系統(tǒng)的裝備庫
擴大CRISPR/Cas9的規(guī)模需要進行相關(guān)的結(jié)果驗證。最簡單的方法就是設(shè)計相關(guān)的基因庫或檢測試劑盒，使得CRISPR/Cas9越來越成熟。
Vermeulen博士對CRISPR/Cas9進行多組實驗后發(fā)現(xiàn)，CRISPR編輯技術(shù)可以永久修改基因組DNA而不是暫時改變RNA的表達水平。DNA的合成能力近年來突飛猛進，研究人員能合成更長的DNA并且可以進行質(zhì)粒的組裝，從而簡化CRISPR基因庫的制備。
ATI可以用來評估CRISPR誘發(fā)突變的細胞系。通過使用高活性的T7核酸內(nèi)切酶及相應(yīng)儀器可以加快CRISPR的實驗進程。長片段的PCR擴增技術(shù)已被高度選擇性的T7DNA酶所取代。含有綠色熒光蛋白（GFP）標記的啟動子可以解決二倍體細胞系中兩個DNA突變鑒別的問題。這種標記可以用來評價細胞中被替換基因的啟動子強度。
3.KateMarusina博士——懷疑論者的“毀滅帝”
在人類的感覺器官中，最容易受損的就是
聽力，而超過50%是遺傳導(dǎo)致的。
為了對此進行研究，科研人員利用斑馬魚進行試驗。聽力受損的斑馬魚表現(xiàn)出一種特征性的循環(huán)游泳行為，以此來與野生型進行區(qū)分。研究人員利用基因編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶（TALENs），使得隱性純合子的胚胎表達降低。而這個結(jié)果，大大減少了斑馬魚的遺傳性聽力損失。
4.MaryAnnLabant——基因編輯造福器官移植
利用CRISPR/Cas9技術(shù)，人類可以解決跨物種移植這個難題，解決人體組織器官的嚴重短缺?？紤]到倫理和兼容性，器官移植一開始把重點放在豬的器官上。然而，1997年發(fā)生的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒事件使得全球禁止進行豬器官的移植，人類將所有的希望集中在轉(zhuǎn)基因豬上。隨后科學家在PK15
豬腎上皮細胞上進行了相關(guān)實驗根除了豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。
Milliporesigma公司推出了各種CRISPR產(chǎn)品，為廣大科研人員服務(wù)。milliporesigma和威康信托基金桑格研究所經(jīng)過兩年的合作，開發(fā)出了第一個基因組文庫篩選系統(tǒng)，從而減少了實驗的時間。
5.MaryAnnLabant——基因編輯路在何方
CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相較于經(jīng)典的基因治療所需時間更短，且基因組編輯組件可以被加載到病毒載體中，加速臨床開發(fā)。早期的基因組編輯使用的是鋅指核酸酶的方法（ZFN）。而CRISPR-Cas9的出現(xiàn)為基因編輯注入了新的活力。但CRISPR-Cas9有一定的局限性，例如靶向性和特異性。CRISPR目前只是用來輔助治療CAR-T細胞以增強其療效。
那么現(xiàn)在，CRISPR基因編輯技術(shù)可以用來做什么？
基因組CRISPR篩選識別調(diào)控蛋白
利用CRISPR進行遺傳篩選可以控制相關(guān)遺傳物質(zhì)。研究人員構(gòu)建了由同一啟動子表達的綠色熒光蛋白（GFP），然后在其中一組的細胞啟動子和GFP之間插入了目標基因調(diào)控元件，另一個組則沒有。在幾個不同的時間點通過對兩組細胞進行流式細胞儀分離細胞，檢測相應(yīng)的熒光強度。通過這一實驗，我們能夠篩選人類蛋白編碼基因，并確定負責調(diào)控相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)基因。
CRISPR/Cas9能夠加快HIV的篩查
和治療
多年來，高通量陣列基因組篩選技術(shù)一直是探究生物相關(guān)通路的標準，用來研究相應(yīng)的生物學機制。CRISPR/Cas9的基因敲除技術(shù)具有高通量檢測的優(yōu)勢，它能轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）與CRISPRRNACas9蛋白的合成和引物RNA。這項研究的重點是確定艾滋病毒感染的新靶點。通過表型、基因編輯率和基因敲除等方法驗證了研究方法的準確性。作者在排除了幾個宿主因子的影響后，證實了預(yù)期的表型，發(fā)現(xiàn)了新的基因靶點。因此，他們展示了利用CRISPR基因敲除篩選方法來確定HIV發(fā)病與新感染宿主之間的關(guān)系。
克服克隆篩選的瓶頸
CRISPR/CAS系統(tǒng)的瓶頸在于對含有致突變和雜合性的克隆體的測序。雖然可以用篩選方法加以解決，但成本和時間大大增加。目前，科學家們正在轉(zhuǎn)向低成本的篩選方法。AATI已經(jīng)開發(fā)出一個強大的T7核酸內(nèi)切酶法，能夠與片段分析儀無縫集成，用來對CRISPR基因編輯的精度進行測定。
高度特異的基因組編輯：
alt-rS.P.HIFICas9核酸酶3nls
許多研究者關(guān)注的一個問題是CRISPR/Cas9系統(tǒng)潛在的脫靶效應(yīng)。通過對alt-rCRISPR-Cas9系統(tǒng)-alt-r化膿性鏈球菌HIFICas9核酸酶3nls進行高效基因組編輯后，其基因編輯效率和精度都大幅提升。IDT的科學家利用Cas9核酸酶使該系統(tǒng)變成更精確的基因組編輯工具。通過對250000多個突變體進行實驗后，他們認為這種酶能有效解決脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。它的優(yōu)越性能已經(jīng)得到了許多實驗室的驗證，這些實驗室對各種生物系統(tǒng)進行了相應(yīng)的轉(zhuǎn)化研究。
杰克遜實驗室的模型建立服務(wù)（MGS）團隊已經(jīng)廣泛使用CRISPR技術(shù)創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因小鼠，他們建立的模型是B淋巴細胞的類開關(guān)重組突變體，這在研究1型糖尿病的發(fā)展中至關(guān)重要。研究人員使用經(jīng)CRISPR處理過的雙陰性Aidca基因小鼠與野生型小鼠進行比較，雙陰性Aidca基因小鼠的1型糖尿病發(fā)病率更低。結(jié)果表明利用CRISPR技術(shù)修改Aidca基因能夠顯著降低1型糖尿病的發(fā)生率。
CRISPR轉(zhuǎn)染技術(shù)治療
多個單基因突變的艾滋病的發(fā)展
CRISPR是一個突破性的技術(shù)，但無論是在基礎(chǔ)研究中或作為一種治療劑，CRISPR基因編輯都必須進入相關(guān)的細胞群中才能發(fā)揮作用。因此在更為復(fù)雜的研究或是臨床研究中，CRISPR轉(zhuǎn)染細胞往往比較困難。MaxCyte是基于流式電穿孔技術(shù)的基因編輯器，它具有轉(zhuǎn)染效率高和細胞存活率高的特點。
加快分析CRISPR/Cas9
產(chǎn)品自動化編輯效率的測量
利用CRISPR/Cas9進行精確的基因修飾需要強大的分析工具來驗證目標是否突變成功，并測量實驗的效率。傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9分析的瓶頸是難以處理大劑量的樣品。經(jīng)典分析方法費時費力，不適于高通量分析。PerkinElmer芯片實驗室的GX核酸分析儀采用相關(guān)的微電流技術(shù)，減少了樣本測序的數(shù)量，大大縮短時間。
代理CRISPR實驗
Milliporesigma具有高效的研發(fā)CRISPR功能實用性的能力。MilliporeSigma能使不具備DNA切割活性的dspCas9突變并將它放置在CRISPR系統(tǒng)附近，使其產(chǎn)生巨大的DNA切割活性。CRISPR代理實驗可以提高三個方面的內(nèi)容：（1）提高基因組編輯的能力，包括基因敲除和插入；（2）增加靶向性，成倍增加目標基因的靶向性；（3）降低目標基因的切割頻率。
在更為自然的生物環(huán)境中
進行蛋白質(zhì)生物學研究
標記序列常常被整合到表達蛋白中，從而對蛋白質(zhì)的功能進行鑒定。然而，許多大尺寸的標記物插入效率低，并且檢測通常僅限于抗體層面，導(dǎo)致這些方法使用受限。Promega公司的科學家們通過一種11個氨基酸的肽標簽敏感的生物發(fā)光檢測方法，來克服CRISPR編輯的局限性。
我們已經(jīng)不再為CRISPR編輯系統(tǒng)的突破感到驚訝，衷心希望這個領(lǐng)域的突破可以盡快推動到臨床，幫助人類真正戰(zhàn)勝各類遺傳病。
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