視錐細(xì)胞是視網(wǎng)膜重要的感光細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)中心敏銳視力和辨色力。根據(jù)光譜吸收特性的不同，可以將視錐細(xì)胞分為3類：藍(lán)錐細(xì)胞（短波長(zhǎng)；S）、綠錐細(xì)胞（中波長(zhǎng)；M）和紅錐細(xì)胞（長(zhǎng)波長(zhǎng)；L）。視錐細(xì)胞先分化為S或者L/M（圖1A），而后向L/M分化的細(xì)胞再選擇表達(dá)L或M視蛋白。影響視蛋白表達(dá)或者功能的基因突變會(huì)導(dǎo)致多種形式的色盲和視網(wǎng)膜變性。我們通過生物體模型對(duì)脊椎動(dòng)物眼睛的各種機(jī)制有了較多了解，但對(duì)人類視網(wǎng)膜單獨(dú)一種視錐細(xì)胞亞型的發(fā)生機(jī)制了解甚少。本文研究者通過干細(xì)胞分化視網(wǎng)膜類器官來研究人類視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞各亞型的機(jī)制（圖1D-K），研究結(jié)果發(fā)表在Science雜志上。

A.視錐細(xì)胞的分化選擇B.人類視網(wǎng)膜中S，L/M細(xì)胞的比例C.類器官中S，L/M細(xì)胞的比例D-K.iPSC誘導(dǎo)分化為類器官的過程

研究者首先比較了分化的視網(wǎng)膜類器官和成人視網(wǎng)膜組織的視錐細(xì)胞亞型特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)成人視網(wǎng)膜與分化200天視網(wǎng)膜類器官有相似的視錐細(xì)胞亞型構(gòu)成比（成人，S=13%，L/M=87%；類器官，S=29%，L/M=71%）（圖1B和C）；兩者比例的差別可能因?yàn)橐暰W(wǎng)膜類器官在6個(gè)月時(shí)還未完全分化成熟。而且視網(wǎng)膜類器官中的S和L/M細(xì)胞均表達(dá)了CRX（一種感受器分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子）（圖2A和E）。另外類器官和視網(wǎng)膜中的視錐細(xì)胞形態(tài)相似：L/M細(xì)胞比S細(xì)胞外節(jié)部分更長(zhǎng)，內(nèi)節(jié)部分更寬（圖2B-D，圖F-H）。類器官中視錐細(xì)胞的外節(jié)部分比成人視網(wǎng)膜要短，而這也與出生后視網(wǎng)膜的成熟過程相一致（圖2D和H）。因此，干細(xì)胞分化視網(wǎng)膜類器官中的視錐細(xì)胞在分布、基因表達(dá)、形態(tài)上均與人類視網(wǎng)膜相似。

在人類視網(wǎng)膜中，S細(xì)胞產(chǎn)生于胚胎11-34周，L/M細(xì)胞產(chǎn)生于胚胎14-37周，因此研究者又對(duì)視網(wǎng)膜類器官視錐細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行了研究，首次觀察到S-視蛋白表達(dá)的時(shí)間為150天（圖2I，L，M），S細(xì)胞的表達(dá)水平在170天開始下降（圖2M），同時(shí)L/M視蛋白開始表達(dá)，且表達(dá)的量逐漸增加直至第300天（圖2K-M）。在人類視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜類器官中觀察到視錐細(xì)胞的先后表達(dá)說明在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中首先特異性表達(dá)S細(xì)胞，后轉(zhuǎn)變?yōu)樘禺愋员磉_(dá)L/M細(xì)胞。接下來研究者又對(duì)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPSC）起源的視網(wǎng)膜類器官進(jìn)行RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)S視蛋白R(shí)NA在第111天開始表達(dá)，在第160天表達(dá)開始下降，而L/M視蛋白R(shí)NA在第160天開始表達(dá)并逐漸增加，直到第180天后表達(dá)穩(wěn)定。這些時(shí)間節(jié)點(diǎn)在類器官和胎兒視網(wǎng)膜中均高度一致，因此類器官的諸多方面均與人類視網(wǎng)膜相似，可以作為一個(gè)揭示視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)展變化機(jī)制的模型。

類器官中視錐細(xì)胞亞型特征與人類視網(wǎng)膜中相一致，A,C-E,G-M:類器官中視錐細(xì)胞的表達(dá)B,D,F,H:人類視網(wǎng)膜中視錐細(xì)胞的表達(dá)L:類器官發(fā)育過程中S：L/M細(xì)胞的比例M:在類器官發(fā)育中S和L/M細(xì)胞的密度N:S-視蛋白的表達(dá)早于L/M-視蛋白，CRX的表達(dá)早于視蛋白。

既往研究表明Thrв2是視錐細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控分子，但是研究者利用CRISPR/Cas9在胚胎干細(xì)胞（ESC）中將Thrв2敲除，但是由此獲得的類器官視錐細(xì)胞各類型比例與野生型類器官?zèng)]有差別（野生型，S=62%，L/M=38%；Thrв2KO，S=59%，L/M=41%；P=0.83）（圖3A-C）。研究者再次利用CRISPR/Cas9將Thrв（Thrв1和Thrв2）敲除，發(fā)現(xiàn)基因敲除的視網(wǎng)膜類器官視錐細(xì)胞均分化為S細(xì)胞（野生型，S=27%，L/M=73%；ThrвKO;S=100%，L/M=0%；P<0.0001）（圖3D,E,H）。在這些突變類器官中，所有的視錐細(xì)胞均表達(dá)S-視蛋白和表現(xiàn)出S細(xì)胞的形態(tài)（圖3I和J）。因此Thrв是人類視網(wǎng)膜中激活L/M細(xì)胞和抑制S細(xì)胞的重要作用基因。

Thrв對(duì)三碘甲狀腺原氨酸（T3）有高親和力，既往在小鼠實(shí)驗(yàn)中改變T3的含量可能會(huì)影響視錐細(xì)胞的比例。因此研究者假設(shè)T3是通過Thrв來影響視錐細(xì)胞分化的。在類器官中，在20到50天起開始加入20nMT3，直到第200天，發(fā)現(xiàn)視錐細(xì)胞大多數(shù)均分化為L(zhǎng)/M細(xì)胞（野生型，S=27%，L/M=73%；野生型+T3，S=4%，L/M=96%；P<0.01）(圖3F和H)。說明早期加入T3可促進(jìn)L/M細(xì)胞分化，抑制S細(xì)胞。而在ThrвKO的類器官中加入T3,卻只有S細(xì)胞（野生型+T3，S=4%，L/M=96%；ThrвKO+T3，S=100%，L/M=0%；P<0.0001）(圖3F-H).因此T3是通過Thrв來促進(jìn)L/M細(xì)胞分化和抑制S細(xì)胞的。

.A.WT類器官視錐細(xì)胞B.Thrв2敲除類器官視錐細(xì)胞C.WT和Thrв2KO的視錐細(xì)胞比例沒有差別D：WT類器官視錐細(xì)胞E：Thrв敲除類器官視錐細(xì)胞F:WT中加入T3的類器官視錐細(xì)胞G:Thrв敲除類器官中加入T3視錐細(xì)胞H:D,E,F,G中視錐細(xì)胞比例的差別I:幾種類器官視錐細(xì)胞外節(jié)部分長(zhǎng)度J:幾種類器官視錐細(xì)胞內(nèi)節(jié)部分長(zhǎng)度K:幾種類器官視錐細(xì)胞的比例差別

接著研究者在類器官發(fā)育的過程中對(duì)其進(jìn)行持續(xù)的基因表達(dá)檢測(cè)，直到第250天，根據(jù)甲狀腺激素的表達(dá)模式可分為三個(gè)階段：改變表達(dá)（圖4A），持續(xù)表達(dá)（圖4B）和無表達(dá)（圖4C），而降解T3和T4的酶的基因DIO3，在早期高表達(dá)，而在后期低表達(dá)（圖4A）。相反，將T4轉(zhuǎn)變?yōu)門3的酶的基因DIO2，在早期低表達(dá)，而隨后表達(dá)逐漸增加。因此Dio3和Dio2表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化支持早期低水平的甲狀腺激素信號(hào)產(chǎn)生S細(xì)胞，而后期高水平的甲狀腺激素信號(hào)產(chǎn)生L/M細(xì)胞。而Thrв的表達(dá)也逐漸增加，與視錐細(xì)胞的分化相一致（圖4A）。而T3/T4的轉(zhuǎn)錄因子，輔酶因子也都隨著類器官的發(fā)育而動(dòng)態(tài)表達(dá)（圖4A和B）。這些均說明Thrв和其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可以對(duì)不同的甲狀腺激素水平進(jìn)行調(diào)控反應(yīng)。促甲狀腺激素釋放激素（TRH）也在類器官和視網(wǎng)膜中動(dòng)態(tài)表達(dá)。因此視網(wǎng)膜是通過內(nèi)部來調(diào)控T3和T4的水平，早期低水平的甲狀腺激素信號(hào)促進(jìn)S細(xì)胞的分化，晚期高水平的甲狀腺激素信號(hào)促進(jìn)L/M細(xì)胞的分化（圖4A）。

A-C:差異表達(dá)基因的熱圖A:改變表達(dá)階段B:持續(xù)表達(dá)階段C:無表達(dá)階段D:DIO3表達(dá)下調(diào)T3和T4的水平，導(dǎo)致S細(xì)胞分化E:DIO2表達(dá)將T4轉(zhuǎn)變?yōu)門3,啟動(dòng)Thrв信號(hào)，抑制S細(xì)胞，誘導(dǎo)L/M細(xì)胞

綜上所述,甲狀腺激素信號(hào)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)能調(diào)控人類視網(wǎng)膜中視錐細(xì)胞的分化，這也為以后治療某些疾病奠定了理論基礎(chǔ)。

點(diǎn)評(píng)：

近年來有大量的研究工作關(guān)注干細(xì)胞（如iPSC）作為疾病模型和在潛在治療方式中的作用，尤其視網(wǎng)膜位于眼內(nèi)，很難獲得活體的細(xì)胞或組織用于研究病理機(jī)制。目前已有多項(xiàng)iPSC向光感受器細(xì)胞、RPE、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系分化相關(guān)的研究，而且已經(jīng)可以在體外將iPSC培養(yǎng)轉(zhuǎn)化為和人視網(wǎng)膜相似的三維立體球形視網(wǎng)膜組織，記錄到光電反應(yīng)波、檢測(cè)到視細(xì)胞標(biāo)記物，甚至包含成熟的光感受器細(xì)胞。通過這些研究方法建立生理或病理模型，克服了難以獲取患者眼組織的難題，能夠有效的研究視網(wǎng)膜發(fā)育和疾病的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，為將來的治療提供重要干預(yù)靶點(diǎn)。此技術(shù)無疑將成為研究視網(wǎng)膜變性疾病的最佳工具。