又一Leber先天性黑矇亞型將被攻克？

2019-05-05 來源：協(xié)和眼科咨詢標(biāo)簽：掌上醫(yī)生喝茶減肥一天瘦一斤安全減肥 cps聯(lián)盟美容護(hù)膚

摘要：人體成纖維細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織體外實(shí)驗(yàn)闡明了EDIT-101作用機(jī)制，并且證明了核酸酶的特異性。SaCas9和gRNA（EDIT-101）轉(zhuǎn)染LCA10患者的成纖維細(xì)胞后，野生型CEP290mRNA升高，同時(shí)突變型CEP290mRNA降低，而且全長的CEP290蛋白表達(dá)增加。

CEP290蛋白位于光感受器的連接纖毛，在外界盤再生和光信號(hào)傳傳導(dǎo)中起重要作用。LCA10型患者中CEP290最常見的突變是剪切突變IVS26（c.2991+1655A>G），這一突變對(duì)視網(wǎng)膜光感受細(xì)胞的影響較大，而對(duì)其他體細(xì)胞影響輕微，因此臨床表型僅局限于眼部。CEP290包含7.5k個(gè)堿基，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過AAV載體的介導(dǎo)能力，為了克服基因替代療法的局限性，研究者通過視網(wǎng)膜下注射的方法，將AAV5載體介導(dǎo)的金黃葡萄球菌Cas9和CEP290特異向?qū)NA（gRNAs）導(dǎo)入光感受器細(xì)胞內(nèi)，這種gRNAs可以更正原有的IVS26突變，從而正常剪切，得到CEP290的正常表達(dá)，并從以下三個(gè)方面證明了該方法（EDIT-101）糾正CEP290IVS26突變的有效性。

1.人體成纖維細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織體外實(shí)驗(yàn)闡明了EDIT-101作用機(jī)制，并且證明了核酸酶的特異性。SaCas9和gRNA（EDIT-101）轉(zhuǎn)染LCA10患者的成纖維細(xì)胞后，野生型CEP290mRNA升高，同時(shí)突變型CEP290mRNA降低，而且全長的CEP290蛋白表達(dá)增加。EDIT-101轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜組織后，也得到了預(yù)期的編輯效果，平均編輯率約為41.7±15.9%。而且這種方法特異性很高，都沒有觀察到脫靶效應(yīng)，具體如下圖所示：

a.EDIT-101的示意圖；b.基因編輯策略示意圖；c,定量PCRqRT–PCR檢測體外成纖維細(xì)胞野生型（藍(lán)色）和IVS26突變型（橙色）CEP290mRNA轉(zhuǎn)錄本；d.人視網(wǎng)膜組織切片的免疫熒光圖片，說明AAV5-hGRK1-GFP體外轉(zhuǎn)染后，在視網(wǎng)膜組織中可以檢測到GFP的表達(dá)。

2.建立CEP290IVS26基因突變敲入小鼠模型，在小鼠模型視網(wǎng)膜下注射EDIT-101，觀察劑量效應(yīng)和藥代動(dòng)力學(xué)，檢測到迅速并且持久的基因編輯效果，而且總體CEP290基因編輯率與SaCas9mRNA和gRNA均相關(guān)。具體結(jié)果如下圖所示：

a.不同濃度EDIT-101在小鼠視網(wǎng)膜下注射后不同時(shí)間點(diǎn)Cas9mRNA和gRNA的表達(dá)；b.不同藥物濃度注射后不同時(shí)間點(diǎn)基因編輯的比例；c.CEP290總體基因編輯率和Cas9mRNA(橙色)、gRNA(藍(lán)色)的相關(guān)性。d.達(dá)到有效CEP290編輯的EDIT-101的劑量反應(yīng)。

3.小鼠缺少黃斑結(jié)構(gòu)，而EDIT-101的設(shè)計(jì)主要是為了恢復(fù)部分視錐細(xì)胞功能，因此研究者又設(shè)計(jì)了用于靈長類動(dòng)物的EDIT-101類似物（VIR026andVIR067），并在靈長類動(dòng)物中證明了其對(duì)CEP290基因編輯的有效性，達(dá)到了治療效果的閾值，表明CRISPR/Cas9技術(shù)可以在靈長類動(dòng)物體細(xì)胞中進(jìn)行有效編輯。

a-d.靈長類動(dòng)物黃斑旁視網(wǎng)膜下注射VIR607（治療組）或者平衡鹽溶液（對(duì)照組）后，SaCas9僅在治療眼的光感受器細(xì)胞中表達(dá)。

作者還比較了不同濃度劑量的藥物在小鼠和靈長類動(dòng)物中的基因編輯率，臨床認(rèn)為基因編輯率>10%即能提高患者的視功能，因此從下表可見當(dāng)藥物濃度達(dá)到1*1012vg/ml時(shí)，便可顯著超過臨床治療有效的閾值。

綜上所述，研究者闡明了基因編輯新藥EDIT-101的原理、藥理作用以及耐受性等，為EDIT-101研發(fā)和下一步臨床實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。而且這項(xiàng)研究表明EDIT-101在靈長類動(dòng)物中無明顯免疫反應(yīng)，并且沒有觀察到脫靶效應(yīng)，安全性好。這項(xiàng)研究不僅可能造福CEP290相關(guān)LCA的患者，而且為其他基因相關(guān)的視網(wǎng)膜變性疾病也提供了新思路。

點(diǎn)評(píng)

Leber先天性黑矇（LCA）作為一種重要的視網(wǎng)膜變性類疾病，其發(fā)病早、危害重，給社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。因此也有越來越多的學(xué)者關(guān)注于相關(guān)疾病的研究，其中典型的代表是RPE65相關(guān)LCA的基因替代治療，相關(guān)藥物L(fēng)UXTURNA目前在美國已上市而且表現(xiàn)出良好的治療效果。但是視網(wǎng)膜變性類疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，很多疾病并不適合套用基因替代治療，比如本文中提到的CEP290，因其堿基數(shù)目龐大，常規(guī)的病毒載體難以介導(dǎo)正常CEP290基因轉(zhuǎn)染。但是CEP290基因有突變熱點(diǎn)，因此本文作者有針對(duì)性的設(shè)計(jì)了相應(yīng)的基因編輯藥物，可以用于治療因此熱點(diǎn)突變導(dǎo)致的視網(wǎng)膜疾病。我們?cè)谑艽斯奈璧耐瑫r(shí)必須清晰的認(rèn)識(shí)到，CEP290突變?cè)谥袊巳褐型蛔兟什桓?，本文提到的熱點(diǎn)突變目前尚未在我國人群中發(fā)現(xiàn)，因此此藥很可能不適用于中國的患者。因此針對(duì)遺傳性視網(wǎng)膜疾病，我們需要根據(jù)不用的遺傳背景和機(jī)制，來研究相應(yīng)的治療方法，不能完全照搬國外的技術(shù)，需要因地制宜，因病施藥。

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