慢性乙型肝炎至今尚未找到徹底治愈的藥物，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來，很多學(xué)者正努力尋找抗HBV新策略。通過多年的積累，人們逐漸發(fā)現(xiàn)隱藏在宿主細(xì)胞內(nèi)的HBVcccDNA是病毒賴以復(fù)制生存的關(guān)鍵。本屆AASLD年會上，經(jīng)過學(xué)術(shù)評議委員會的嚴(yán)格篩選，AASLD評選出了本年度關(guān)于“乙型肝炎新治療和新靶點(diǎn)”的6項(xiàng)重要研究，RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用已占據(jù)了半壁江山。令人驚訝的是，本屆AASLD主席GyongyiSzabo女士特別邀請到RNA干擾技術(shù)之父、2006年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主——CraigC.Mello教授做主旨報(bào)告，相信這并非純粹的巧合。目前，這些RNA干擾藥物都取得了較好的臨床前研究結(jié)果，期待在不久的未來，這一新型抗HBV藥物將徹底解決慢性乙型肝炎這一難題。

　　RNA干擾藥物ARC-520在動(dòng)物模型中可有效降低cccDNA水平

　　ARC-520是以全部cccDNA的轉(zhuǎn)錄為靶點(diǎn)的RNA干擾性藥物。前期的研究表明，HBV感染患者應(yīng)用單劑ARC-520治療后，病毒抗原水平可持續(xù)降低1個(gè)月以上。美國Arrowhead研究公司W(wǎng)ooddell等在AASLD年會上報(bào)告了應(yīng)用多劑ARC-520對HBV感染黑猩猩肝臟HBVDNA和RNA的效果

　　Wooddell博士介紹說：“我們在9只HBV感染的黑猩猩（5只雄性，4只雌性）中觀察了ARC-520治療（每月1次，共6~11次）的效果。HBeAg陽性組（n=5）與陰性組（n=4）的基線血清DNA分別為為8~9logIU/mL和≤3logIU/mL。在給予ARC-520之前，均應(yīng)用NA治療8~24周。”

　　在基線、完成NA導(dǎo)入和ARC-520治療后進(jìn)行肝活檢，應(yīng)用qPCR檢測HBVDNA和cccDNA，應(yīng)用RT-qPCR檢測前核心/核心RNA（C探針）和總HBVRNA（總探針）。

　　目前的研究表明：?①應(yīng)用核苷（酸）類似物（NA）治療的HBeAg陽性黑猩猩加用ARC-520后，可使肝臟總DNA和cccDNA水平進(jìn)一步降低；②ARC-520可使HBVRNA和抗原減少，而NA無法實(shí)現(xiàn)；③對于慢性HBV感染者，尤其是HBeAg陰性者，HBVDNA整合是HBsAg持續(xù)陽性的重要原因。

　　魯鳳民教授：CRISPR/Cas9系統(tǒng)及RNAi方法可促使cccDNA清除

　　我國北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系魯鳳民教授課題組利用RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)出一種新型基因組編輯工具CRISPR/Cas9系統(tǒng)，它可有效破壞HBV表達(dá)模板，且無明顯的細(xì)胞毒性。這項(xiàng)研究在今年的8月28日，已發(fā)表在WorldJGastroenterol雜志上。

　　研究人員總共設(shè)計(jì)出了對抗HBVA-D基因型的15種gRNAs，選出了覆蓋HBV調(diào)控區(qū)域的11個(gè)雙gRNAs組合。結(jié)果顯示所有g(shù)RNAs都可以顯著減少培養(yǎng)物上清液中HBsAg或HBeAg生成，這取決于gRNA對抗的區(qū)域。所有的雙gRNAs都可以有效抑制HBVA-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，與單gRNA相比，雙gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。

　　此外，通過PCR直接測序技術(shù)，他們證實(shí)了這些雙gRNAs可通過除去兩gRNAs切割位點(diǎn)之間的片段來破壞HBV表達(dá)模板。更重要的是，gRNA-5和gRNA-12組合不僅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，還能夠破壞HepAD38細(xì)胞中的cccDNA儲存庫。

　　魯鳳民教授表示：“我們的研究表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效破壞HBV表達(dá)模板，并且有很好的安全性。它可能成為根除慢性HBV感染患者中持續(xù)存在的HBVcccDNA的一種有效手段。”

　　ALN-HBV可介導(dǎo)強(qiáng)力持久的HBV沉默

　　以HBV基因組為靶點(diǎn)的RNA干擾，有望通過有效降低所有病毒基因產(chǎn)物，包括HBsAg等病毒抗原的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)HBV感染的“功能性治愈”。美國Alnylam制藥公司Sepp-Lorenzino等的研究表明，針對肝細(xì)胞的siRNA偶聯(lián)物—ALN-HBV以HBV基因組內(nèi)的高度保守區(qū)為靶點(diǎn)，可介導(dǎo)特異、強(qiáng)力和持久的HBV病毒轉(zhuǎn)錄沉默和HBsAg表達(dá)沉默。

　　ALN-HBV是一種化學(xué)穩(wěn)定性增強(qiáng)、針對肝細(xì)胞的GalNAc-siRNA偶聯(lián)物，其靶點(diǎn)為HBVX蛋白開放閱讀框（ORF）的一個(gè)位點(diǎn)，因此，可針對所有四種HBVRNA轉(zhuǎn)錄體，通過RNA干擾發(fā)揮降解作用。生物信息學(xué)分析表明，它與合并A-J基因型HBV的全長病毒基因組的序列同源性>95%，對宿主基因的脫靶活性非常低。

　　在AAV-HBV小鼠模型中，以3mg/kg單次皮下注射ANL-HBV后10~15天，血漿HBsAg平均下降1.6logIU/mL（最多下降3.6logIU/mL），在每周一次3mg/kg治療3次后，平均HBsAg沉默>2.9logIU/mL，HBsAg低于定量水平（<0.05ng/mL），在最后一劑后，HBsAg沉默持續(xù)超過100天。此外，在大鼠藥代動(dòng)力學(xué)和肝臟暴露的研究結(jié)果顯示有良好的耐受性。

　　目前，研究者正在進(jìn)行其他藥理學(xué)研究，包括ALN-PDL的聯(lián)合研究，PDL是針對肝細(xì)胞內(nèi)PD-L1的一種RNA干擾藥物，ALN-PDL有望增強(qiáng)肝內(nèi)的HBV特異性細(xì)胞免疫，從而提高局部對HBV感染的免疫控制，同時(shí)避免全身免疫檢查點(diǎn)阻斷的免疫毒性。

　　延伸閱讀——RNA干擾的作用機(jī)制

　　病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23bp），即siRNA。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNA干擾（RNAi）的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

　　RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細(xì)胞內(nèi)。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達(dá)具有潛在高效性，任何導(dǎo)致正常機(jī)體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應(yīng)基因沉默。所以正常機(jī)體內(nèi)各種基因有效表達(dá)有一套嚴(yán)密防止dsRNA形成的機(jī)制。

　　RNAi具有以下特征：

　　1.RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；

　　2.RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA；

　　3.RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，表型可以達(dá)到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子（數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量）就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，是以催化放大的方式進(jìn)行的；

　　4.RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳等特點(diǎn)；

　　5.dsRNA不得短于21個(gè)堿基，并且長鏈dsRNA也在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA，并由siRNA來介導(dǎo)mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的基因表達(dá)受抑和凋亡；

　　6.ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個(gè)ATP依賴的過程?？赡苁荄icer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ATP提供能量。