從2013年張鋒[1]和GeorgeChurch[2]第一次使用CRISPR-Cas9編輯人體細(xì)胞算起，這項(xiàng)技術(shù)在人體細(xì)胞中的使用已經(jīng)走過(guò)5個(gè)年頭。

雖然CRISPR被科學(xué)家使用的很溜，并已經(jīng)走到臨床試驗(yàn)階段；但我們對(duì)Cas9的切割原理和切割后細(xì)胞修復(fù)機(jī)制的了解還比較少，甚至可以說(shuō)它們還是個(gè)黑盒子。

前不久，上海交通大學(xué)吳強(qiáng)教授課題組在MolecularCell上發(fā)表了一篇文章，他們發(fā)現(xiàn)Cas9切割DNA雙鏈可以產(chǎn)生突出末端，而不僅僅是平頭末端，這顛覆了我們對(duì)Cas9切割的認(rèn)知[3]。

近日，加州大學(xué)伯克利分校的JacobCorn團(tuán)隊(duì)在Cas9切割后的修復(fù)機(jī)制上也取得了顛覆認(rèn)知的重大突破。

總的來(lái)說(shuō)，Corn團(tuán)隊(duì)這次解決了一個(gè)長(zhǎng)期困擾科學(xué)家的問(wèn)題：用CRISPR-Cas9切斷細(xì)胞的DNA之后，細(xì)胞究竟是如何選擇用哪種方式修補(bǔ)斷裂的缺口的？

更重要的是，他們的這個(gè)發(fā)現(xiàn)甚至可以讓科學(xué)家以后根據(jù)自己的需求，操縱細(xì)胞的修復(fù)方式，讓細(xì)胞基因組DNA在被Cas9切斷后，按照需求去修復(fù)缺口。正真實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)切割，精準(zhǔn)修補(bǔ)。

這對(duì)很多需要做基因修復(fù)的遺傳疾病而言，無(wú)疑是個(gè)好消息。上周四，Corn團(tuán)隊(duì)的這一重要研究成果發(fā)表在《自然遺傳學(xué)》上[4]。

CRISPR-Cas9只是上帝的手術(shù)刀，修復(fù)還是得靠細(xì)胞

一直以來(lái)，我們都形象地把CRISPR-Cas9叫做“上帝的手術(shù)刀”，而不把它叫做“上帝的針線(xiàn)包”，主要是因?yàn)镃as9只負(fù)責(zé)精準(zhǔn)的切斷DNA，修復(fù)的任務(wù)要交給細(xì)胞自身。

通常情況下，CRISPR-Cas9切斷DNA形成的雙鏈斷裂后，細(xì)胞會(huì)很快啟動(dòng)緊急修復(fù)機(jī)制。其中最主要的兩條是：非同源末端連接和同源重組。

其中非同源末端連接修復(fù)機(jī)制被科學(xué)家用的最多，效率也最高。它就是不管三七二十一，盡快把斷裂的DNA連接起來(lái)，維持DNA的穩(wěn)定。這種修復(fù)方式絕大部分情況下會(huì)在切割位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)插入或缺失，直接導(dǎo)致基因功能喪失。

無(wú)論如何，對(duì)細(xì)胞而言，損失一個(gè)基因，比掛了肯定好多了。這種修復(fù)方式其實(shí)也是細(xì)胞的最常見(jiàn)修復(fù)方式。鑒于這種修復(fù)方式的特點(diǎn)，它被廣泛用于基因功能的研究。

而同源重組修復(fù)機(jī)制，則是在有同源供體DNA序列的配合下，用一段正確的基因序列替換原本錯(cuò)誤的基因序列[5]。也就是我們常說(shuō)的：哪里壞了，換哪里?？茖W(xué)家和醫(yī)生治療基因變異導(dǎo)致的疾病，依賴(lài)的就是這種修復(fù)方式[6]。

目前，同源重組修復(fù)過(guò)程中使用的外源DNA模版有兩種：一種是雙鏈DNA，另一種是單鏈DNA模版修復(fù)（SSTR）。

CRISPR/Cas9切斷DNA之后的可能修復(fù)機(jī)制

不過(guò)，大量的研究表明，把雙鏈DNA作為模版修復(fù)斷裂的DNA在絕大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中是非常低效的[7]。相較而言呢，以單鏈DNA為修復(fù)模版的SSTR模式在人類(lèi)細(xì)胞中倒是很高效[8]，所以使用的也比較多。

雖然SSTR效率高，但是Corn團(tuán)隊(duì)在不同的人類(lèi)癌細(xì)胞系中做研究還是發(fā)現(xiàn)，SSTR的修復(fù)效率還是有很大的差異，從完全無(wú)效的0%，到非常高效的30%。這似乎暗示，SSTR是否能完成修復(fù)與細(xì)胞類(lèi)型有一定的關(guān)聯(lián)。

再仔細(xì)一想呢，不同細(xì)胞類(lèi)型的基因表達(dá)水平實(shí)際上是相差很大的，是不是某些特殊的DNA修復(fù)通路的打開(kāi)或關(guān)閉，影響了SSTR修復(fù)的效率呢？

如果我們能發(fā)現(xiàn)影響SSTR修復(fù)機(jī)制的相關(guān)基因，那么在以后的臨床應(yīng)用中，在編輯基因的同時(shí)，特異性的調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平。那轉(zhuǎn)化效率就可以大幅提升，治療效果也會(huì)穩(wěn)步提升啊。

研究人員趕緊去查查相關(guān)資料。

很幸運(yùn)，SSTR在人體中修復(fù)的機(jī)制還鮮為人知。如果能解決這個(gè)困擾著很多科學(xué)家的問(wèn)題，那么Corn團(tuán)隊(duì)肯定很開(kāi)心。

此處應(yīng)該再次出現(xiàn)斯托帕德那句話(huà)：“再一次一無(wú)所知，從頭開(kāi)始……這讓我很開(kāi)心。”

聰明的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Corn團(tuán)隊(duì)的研究人員究竟有多開(kāi)心我是沒(méi)辦法知道了。不過(guò)，當(dāng)我看到他們解決問(wèn)題的思路時(shí)，我何止是很開(kāi)心，簡(jiǎn)直是很興奮，以至于喝了5杯濃茶也沒(méi)驅(qū)散的午間睡意，瞬間消散。

他們首先做了一個(gè)假設(shè)：既然是DNA斷裂的修復(fù)出現(xiàn)了不穩(wěn)定的問(wèn)題，那問(wèn)題應(yīng)該就處在細(xì)胞內(nèi)跟DNA修復(fù)有關(guān)的基因上；如果在調(diào)控那些修復(fù)基因表達(dá)的同時(shí)，同步開(kāi)展CRISPR-Cas9的剪切，和切斷后的SSTR修復(fù)，不就可以通過(guò)二者之間的相互作用找到影響SSTR的關(guān)鍵基因了嗎！

于是，研究人員首先找到了2000多個(gè)跟DNA修復(fù)有關(guān)的基因。然后做了一個(gè)非常聰敏的設(shè)計(jì)。

他們創(chuàng)造性的使用了CRISPRi基因沉默技術(shù)[9]、CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)，創(chuàng)建了一個(gè)可視化的“沉默-編輯”平臺(tái)。

首先，他們給所有的細(xì)胞加了個(gè)藍(lán)色熒光基因，讓這些細(xì)胞發(fā)藍(lán)光。

所有的細(xì)胞都藍(lán)瑩瑩的，真好看~

然后，給這些細(xì)胞分別裝入用來(lái)沉默修復(fù)相關(guān)基因的CRISPRi基因沉默系統(tǒng)。每個(gè)細(xì)胞沉默掉一個(gè)修復(fù)相關(guān)基因，在一個(gè)有數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的群體中，就產(chǎn)生了2000個(gè)基因分別被沉默掉的細(xì)胞庫(kù)。

緊接著，研究人員就要對(duì)那個(gè)藍(lán)色熒光蛋白基因下手了。

他們把靶向切割藍(lán)色熒光蛋白基因的CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)，以及一個(gè)與藍(lán)色熒光蛋白基因有同源臂的綠色熒光蛋白基因的單鏈DNA，一起轉(zhuǎn)到上面的那個(gè)細(xì)胞庫(kù)里。

接下里會(huì)發(fā)生什么，你們肯定能想到把，還需要我說(shuō)嗎~

忍不住了，我還是說(shuō)下吧。

理想狀況下（我們只說(shuō)理想狀況下），上面的細(xì)胞庫(kù)顏色會(huì)發(fā)生如下變化。有些還是藍(lán)色，意味著基因編輯失敗；有一些細(xì)胞沒(méi)有顏色了，大概率意味著意味著Cas9把藍(lán)色熒光蛋白基因切斷了，然后細(xì)胞按照非同源末端連接的方式又把它隨便連上了，導(dǎo)致基因功能喪失了；剩下的細(xì)胞成功變綠了，這些細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了SSTR修復(fù)。

研究人員用流式細(xì)胞儀按照顏色，給所有的細(xì)胞分分成三撥：有6.8%的細(xì)胞還保持這藍(lán)色，有67.5%的細(xì)胞不顯色了，22.8%的細(xì)胞變成了綠色。

加起來(lái)是97.1%，還有2.9%的細(xì)胞怎么了？這些細(xì)胞出現(xiàn)了理想狀況之外的情況，我們就不管它們了。

未被重視的“交通信號(hào)燈”

有了上面的細(xì)胞。接下來(lái)的事情就好辦了，用二代測(cè)序技術(shù)，分析分析這三個(gè)細(xì)胞群體中g(shù)RNA的水平變化，就可以知道哪些基因會(huì)影響SSTR的效率了。

這一分析不要緊，研究人員發(fā)現(xiàn)之前認(rèn)為與SSTR修復(fù)有關(guān)的DNA修復(fù)基因，似乎與SSTR關(guān)系并不大。

讓研究人員意外的是，那些處在范科尼貧血（Fanconianemia；FA）的通路上的基因，與SSTR關(guān)系密切。

范科尼貧血是瑞士兒科醫(yī)生GuidoFanconi在1927年首次報(bào)道的，它是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性血液系統(tǒng)疾病[10]。1992年報(bào)道了4個(gè)可能與FA相關(guān)的基因，到現(xiàn)在已經(jīng)鑒定出了20多個(gè)與FA的發(fā)病有關(guān)的基因變異。

一直以來(lái)，研究人員認(rèn)為，F(xiàn)A通路上的基因編碼的蛋白與識(shí)別和修復(fù)基因組中的鏈間交聯(lián)（ICL）有關(guān)。并不認(rèn)為它與CRISPR-Cas9導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂修復(fù)有關(guān)。

這個(gè)發(fā)現(xiàn)，被研究人員視為至寶。

為了進(jìn)一步證實(shí)FADNA修復(fù)通路上的蛋白與SSTR修復(fù)模式效率之間的關(guān)系。研究人員用CRISPRi分別穩(wěn)定地敲低了FA路徑中的FANCA，F(xiàn)ANCD2，F(xiàn)ANCE，F(xiàn)ANCF，F(xiàn)ANCL，HELQ，UBE2T，USP1和WDR48。發(fā)現(xiàn)SSTR修復(fù)模式效率顯著下降。

如果在敲低的同時(shí)，用cDNA在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)那個(gè)敲低的蛋白，讓它們的表達(dá)恢復(fù)到野生的水平。研究人員發(fā)現(xiàn)，SSTR修復(fù)模式效率提升8倍，回升到正常水平。

這些研究表明，F(xiàn)A通路中的許多基因?qū)STR修復(fù)模式是必需的。

更有意思的是，研究人員還發(fā)現(xiàn)FA通路只影響SSTR，它不會(huì)促進(jìn)非同源末端連接。總體來(lái)說(shuō)，在DNA被切斷之后，細(xì)胞修復(fù)DNA的首選方式是非同源末端連接，這也是為什么這種修復(fù)方式一直比例最高。

而FA通路更像個(gè)“交通信號(hào)燈”：在FA通路不活躍的時(shí)候，所有的車(chē)都朝一個(gè)方向（非同源末端連接）開(kāi)；但如果FA通路很活躍，那么它就要指揮其中一部分車(chē)往另一個(gè)方向（SSTR）走。

原來(lái)是這樣！

用論文第一作者ChrisRichardson的話(huà)說(shuō)，就是“FA通路是維持非同源末端連接和SSTR之間平衡的”。

后記

“治療鐮狀細(xì)胞貧血，成功的機(jī)會(huì)與用正確的基因替代突變的基因效率密不可分，”Richardson這么評(píng)價(jià)自己的研究[11]，“如果你從患者那里獲得了100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，30%-40%的替換率肯定比10%的好多了。”

現(xiàn)在看來(lái)，Richardson的愿望真的有可能實(shí)現(xiàn)了。

將來(lái)，科學(xué)家可以通過(guò)分析細(xì)胞基因的表達(dá)水平，提前預(yù)知一類(lèi)細(xì)胞是否適合SSTR。如果這類(lèi)細(xì)胞SSTR效率低，甚至可以考慮臨時(shí)激活FA通路。

無(wú)論如何，科學(xué)家掌握了Cas9切割后的這層修復(fù)機(jī)制，未來(lái)給患者換個(gè)基因啥的，那簡(jiǎn)直是效率高多了。