盡管研究了幾十年，但許多癌癥的原因似乎很大程度上仍然是未解之謎。不過，也有一些類型的癌癥，其惡性驅(qū)動(dòng)因素已經(jīng)被置于聚光燈下。科學(xué)家知道，99%的宮頸癌病例是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的1。HPV是一種大的DNA病毒，可在粘膜的角質(zhì)化細(xì)胞、以及皮膚上形成感染，引起鱗狀細(xì)胞乳頭狀瘤或疣。如果HPV是大多數(shù)宮頸癌的成因，那么它是否也會(huì)導(dǎo)致某些皮膚癌？

HPV和宮頸癌之間的密切關(guān)聯(lián)引發(fā)了EmilieHultin博士的好奇：HPV和非黑色素瘤皮膚癌之間是否也存在關(guān)聯(lián)。作為瑞典卡羅林斯卡研究所的一名遺傳學(xué)家，Hultin博士的HPV研究已經(jīng)從芯片轉(zhuǎn)移到新一代測(cè)序(NGS)，以揭示非黑色素瘤皮膚癌中存在的新型HPV。憑借Illumina的HiSeq?、MiSeq?和NextSeq?系統(tǒng)，她的研究凸顯出NGS解決一部分醫(yī)學(xué)上最大謎題的能力。

揭開HPV的秘密

Hultin博士的科學(xué)生涯是從瑞典斯德哥爾摩的皇家理工學(xué)院（KTH）開始的，她研究的是化學(xué)工程。在攻讀博士期間，她致力于為開展基于芯片的SNP基因分型和HPV分型開發(fā)新的技術(shù)和方法。在工作了兩年之后，Hultin博士于2011年加入卡羅林斯卡研究所。她目前是JoakimDillner博士實(shí)驗(yàn)室的一名研究協(xié)調(diào)員，負(fù)責(zé)研究組的深度測(cè)序?qū)嶒?yàn)室。

Hultin和Dillner博士都對(duì)鑒定與各種人類疾病（特別是癌癥）相關(guān)聯(lián)的病毒很感興趣。他們的工作主要集中在檢測(cè)HPV和宮頸癌之間的致病關(guān)聯(lián)。在生殖道中，某些類型的高危HPV病毒更有可能讓宮頸細(xì)胞癌變，而低危的HPV病毒則僅限于引起生殖器疣。由于HPV也能感染皮膚，他們決定調(diào)查HPV-癌癥的關(guān)聯(lián)是否也包含非黑色素瘤皮膚癌。之所以將黑色素瘤排除在外，是因?yàn)樗c日照有密切關(guān)聯(lián)。

“我們知道皮膚上有許多HPV病毒株，但不敢肯定它們是否引起非黑色素瘤皮膚癌，”Hultin博士談道。“要想確定關(guān)聯(lián)的存在，需要鑒定皮膚樣本中的少量HPVDNA。這不是一項(xiàng)輕松的任務(wù)。”

他們并不知道要尋找什么，因此他們?cè)谘芯窟^程中使用了NGS。“芯片技術(shù)是針對(duì)已知的DNA序列，因此我們無法用它來鑒定新病毒，”Hultin博士說。“NGS讓我們能對(duì)皮膚樣本中的所有DNA進(jìn)行測(cè)序，從而可以檢測(cè)新型HPV。”

Hultin博士加入Dillner博士的實(shí)驗(yàn)室時(shí)，正趕上他們購買第一臺(tái)NGS測(cè)序儀，Roche454系統(tǒng)。研究團(tuán)隊(duì)后來使用一個(gè)中心實(shí)驗(yàn)室的ThermoFisherScientificIonTorrent測(cè)序系統(tǒng)。不久他們認(rèn)識(shí)到，這兩臺(tái)系統(tǒng)都不能提供尋找新病毒所需的測(cè)序深度。“病毒信號(hào)淹沒在樣本中極大量的皮膚細(xì)胞DNA中，”Hultin博士說。“實(shí)際上只有0.2%-0.5%的測(cè)序read是病毒DNA，其余都是人的。我們也需要一臺(tái)可以同時(shí)進(jìn)行多樣本分析的測(cè)序系統(tǒng)，這樣測(cè)序起來比較經(jīng)濟(jì)。如果每個(gè)測(cè)序運(yùn)行只運(yùn)行一個(gè)樣本，這太奢侈了。”

MiSeq系統(tǒng)揭開皮膚中的HPV多樣性

MiSeq系統(tǒng)則是一個(gè)完美的替代，既滿足他們的深度測(cè)序要求，每次運(yùn)行又能夠分析96個(gè)樣本。他們對(duì)MiSeq平臺(tái)、454和IonTorrent系統(tǒng)進(jìn)行了逐項(xiàng)比較，想看看每個(gè)系統(tǒng)的表現(xiàn)如何。MiSeq系統(tǒng)成功做到了，與其他系統(tǒng)相比，它提供更多reads，測(cè)序深度高出其他測(cè)序系統(tǒng)1000倍。然而，這項(xiàng)研究還不僅僅是測(cè)序儀之間的對(duì)決。Hultin博士和她的團(tuán)隊(duì)利用這些系統(tǒng)開展了一系列研究，尋找了142個(gè)不同皮膚樣本中的新型病毒，這些樣本來自患有光化性角化病、基底和鱗狀細(xì)胞癌的免疫抑制個(gè)體2。

EmilieHultin博士是瑞典卡羅林斯卡研究所的一名研究協(xié)調(diào)員

研究樣本包含了全基因組擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增的樣本混合物。“對(duì)無偏好和偏好性樣本混合物進(jìn)行測(cè)序有一個(gè)優(yōu)勢(shì)，”Hultin博士說。“當(dāng)我們對(duì)無偏好的全基因組擴(kuò)增材料進(jìn)行測(cè)序時(shí)，能夠檢測(cè)更多的HPV類型，但同時(shí)也得到大量人類序列。PCR擴(kuò)增的樣本讓我們能夠獲得更多只含有HPV的序列。不過，我們也會(huì)錯(cuò)過一些類型的HPV，它們與我們使用的引物不匹配。”

兩種樣本的混合物需要用兩種不同的Illumina文庫制備試劑盒。“我們使用Nextera?DNALibraryPreparationKit來制備82個(gè)樣本的全基因組擴(kuò)增文庫，只需要1-2天就能制備好所有樣本的文庫，”Hultin博士說。“在制備樣本的同時(shí)可以對(duì)整塊板進(jìn)行分析是很方便的。”

“MiSeq系統(tǒng)鑒定出454和IonTorrent系統(tǒng)無法找到的HPV類型。”

“我們也使用經(jīng)過特定PCR引物擴(kuò)增的樣本，形成約450bp的擴(kuò)增子，”Hultin博士補(bǔ)充道。“這個(gè)大小很合適，因此我們使用TruSeq?NanoDNALibraryPreparationKit來制備。我們跳過了片段化、末端修復(fù)和大小篩選的步驟，直接將測(cè)序接頭與PCR產(chǎn)物的末端連接。Illumina的文庫制備操作和MiSeq的流程大大減少了我們實(shí)驗(yàn)室的手動(dòng)操作時(shí)間。”

這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了意想不到的多樣性，至少有396種HPV包含之前未鑒定出的229種假定病毒。相比之下，早期在454和IonTorrent系統(tǒng)上開展的測(cè)序研究鑒定出273種不同的HPV，其中只有47種未知病毒。

Hultin博士說：“之前認(rèn)為，我們只會(huì)發(fā)現(xiàn)少量的幾種新型的HPV，因?yàn)閷?duì)皮膚HPV的研究不太多。但完全沒想到皮膚HPV有著如此極端的多樣性。MiSeq系統(tǒng)鑒定出了用454和IonTorrent系統(tǒng)所沒有找到的HPV類型。”

在使用454和IonTorrent系統(tǒng)兩年后，Hultin博士轉(zhuǎn)到了MiSeq系統(tǒng)，這使她在研究上取得了更大的進(jìn)展。“我們轉(zhuǎn)到MiSeq系統(tǒng)之后，才達(dá)到我們所需的測(cè)序深度，并產(chǎn)生足以讓我們鑒定出新型HPV的數(shù)據(jù)，”Hultin博士說。“這項(xiàng)研究的結(jié)果標(biāo)志著我們對(duì)HPV多樣性的認(rèn)識(shí)有了根本的轉(zhuǎn)變。”

短讀長(zhǎng)測(cè)序鑒定新型HPV

研究團(tuán)隊(duì)繼續(xù)開展他們的研究，對(duì)血清、新鮮冷凍（FF）活檢樣本以及福爾馬林固定、石蠟包埋的（FFPE）皮膚樣本進(jìn)行測(cè)序。由于FFPE樣本中的DNA是高度降解的，他們認(rèn)為較長(zhǎng)的序列也許能更好地鑒定新型HPV。不過在實(shí)際研究中，他們發(fā)現(xiàn)讀長(zhǎng)較短的雙端測(cè)序（151bp）為FFPE樣本帶來了最好的結(jié)果。

利用HiSeq和MiSeq系統(tǒng)，Hultin博士領(lǐng)導(dǎo)了一項(xiàng)后續(xù)研究，在91個(gè)皮膚樣本中尋找HPV，這些樣本來自角化棘皮瘤、光化性角化病和基底細(xì)胞瘤，包含F(xiàn)F活檢和FFPE樣本3。利用雙序列標(biāo)簽在HiSeq系統(tǒng)上開展的多重、雙端測(cè)序讓他們能以一種無偏好性的方式對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序。他們發(fā)現(xiàn)四種過去未知的假定HPV類型，包括HPV197，它大量存在于不同的癌癥樣本中。HPV197與親緣關(guān)系最近的HPV只有75%是相同的。它的引物區(qū)域存在許多核苷酸差異，這可能抑制了PCR擴(kuò)增。

“如果不使用無偏好性的方法，HPV197將無法被發(fā)現(xiàn)，”Hultin博士說。“這種病毒大量存在于非黑色素瘤皮膚癌樣本中，似乎是一種非常重要的皮膚HPV類型。”

向NextSeq500系統(tǒng)的轉(zhuǎn)變

2014年6月，Hultin博士在實(shí)驗(yàn)室中添置了一臺(tái)NextSeq500系統(tǒng)，并為其性能激動(dòng)不已。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，無論他們是否開展PCR擴(kuò)增，NextSeq500系統(tǒng)都是完美之選。“NextSeq500系統(tǒng)讓我們能高效測(cè)序FFPE樣本，并通過FF活檢樣本組裝新病毒，”Hultin博士說，“它帶來了更高的測(cè)序深度以及測(cè)序96個(gè)樣本混合物的能力。我們的研究大部分轉(zhuǎn)移到NextSeq500系統(tǒng)，只利用MiSeq系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證或前期試驗(yàn)研究。”

研究團(tuán)隊(duì)的生物信息學(xué)pipeline是為雙端測(cè)序的數(shù)據(jù)優(yōu)化的?？紤]到HPV這種病毒能夠整合到宿主基因組中，NextSeq500系統(tǒng)上的雙端測(cè)序讓Hultin博士能夠鑒定病毒的整合位置。“我們可以在堿基對(duì)的水平上進(jìn)行分析，看看這個(gè)堿基對(duì)是否對(duì)應(yīng)這個(gè)病毒，以及下一堿基對(duì)是否對(duì)應(yīng)到人類基因組，”Hultin博士這樣解釋。

“如果不使用無偏好性的方法，HPV197將無法被發(fā)現(xiàn)。”

Hultin博士對(duì)NextSeq500系統(tǒng)的性能以及它的簡(jiǎn)單易用感到興奮不已。“MiSeq系統(tǒng)的培訓(xùn)非常簡(jiǎn)單，我們想不到測(cè)序還可以更簡(jiǎn)單，”Hultin博士說。“之后，我們接受了NextSeq500系統(tǒng)的培訓(xùn)，意識(shí)到Illumina確實(shí)讓測(cè)序又變得輕松了很多。我們幾乎不需要任何培訓(xùn)。”

癌癥和免疫系統(tǒng)疾病的病毒病因?qū)W

NGS打開了一扇窗，讓人們了解到存在的HPV病毒類型的數(shù)量。“幾年前，我們只知道大約100種不同的HPV病毒類型，”Hultin博士指出。“而如今已經(jīng)鑒定出200多種類型了。”

在HPV上獲得的成功讓研究人員能夠更廣泛地去了解病毒在癌癥以及那些削弱免疫系統(tǒng)的疾病和紊亂中的作用。諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、首個(gè)發(fā)現(xiàn)HPV作用的HaraldzurHausen博士提出，免疫抑制的個(gè)體更有可能患上由病毒引起的癌癥，因?yàn)樗麄冏陨淼拿庖呦到y(tǒng)不再能夠控制感染。艾滋病就是一個(gè)例子，患者患上非黑色素瘤皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)更高，如卡波西肉瘤（Kaposi’ssarcoma）。

“NextSeq500系統(tǒng)讓我們能高效測(cè)序FFPE樣本，并通過FF活檢樣本組裝新病毒。”

Hultin博士及其團(tuán)隊(duì)一直在尋找與免疫抑制相關(guān)的癌癥中的病毒特征，希望找到潛在的病毒關(guān)聯(lián)。他們也在開展多發(fā)性硬化（MS）的研究，看看是否有病毒病因?qū)W的證據(jù)。Hultin博士已經(jīng)得到了多發(fā)性硬化患者在診斷前幾年采集的血清樣本，以鑒定病毒是否與多發(fā)性硬化相關(guān)聯(lián)。首次的NextSeq500系統(tǒng)測(cè)序運(yùn)行已經(jīng)完成，研究正進(jìn)入確認(rèn)階段。

盡管HPV在宮頸癌中的作用已逐漸清晰，但科學(xué)家對(duì)HPV及其他病毒在癌癥發(fā)展中的作用的認(rèn)識(shí)才剛剛開始。Hultin博士相信，更多類型的癌癥可能有病毒病原學(xué)的證據(jù)，即使病毒感染不會(huì)自動(dòng)地引起癌癥。有了NGS的幫助，她相信最終能找到這些特征。