近年來，隨著對基因組學(xué)研究的逐漸深入，人們對腫瘤基因組的認識逐漸加深；在此基礎(chǔ)上，隨著第二代測序技術(shù)飛速發(fā)展，全基因組測序得以實現(xiàn)，各種新技術(shù)層出不窮。循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測就是其中重要的一員。該技術(shù)旨在通過檢測存在于患者血清中的腫瘤DNA，達到“無創(chuàng)活檢”的目的，在腫瘤早期疾病篩查、評估疾病進展、術(shù)后監(jiān)測隨訪等方面具有巨大的臨床應(yīng)用潛能。作為一個血清學(xué)標志物，它具有無創(chuàng)、精準的特性，目前在惡性腫瘤、良性疾病和產(chǎn)前檢查領(lǐng)域中均有研究。

循環(huán)腫瘤DNA

早在1948年，Mandel和Métais就在人類的血液中發(fā)現(xiàn)了獨立于細胞之外的游離DNA（cfDNA）。1977年，S.A.Leon等通過放射免疫分析的方法，發(fā)現(xiàn)血清cfDNA水平與腫瘤的相關(guān)性。他們以125I標記DNA，檢測血清中的cfDNA，分別觀察173例不同腫瘤患者和55例健康對照后發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者體內(nèi)cfDNA水平顯著升高；而接受放射治療后，部分患者體內(nèi)cfDNA水平顯著降低，其水平與腫瘤大小、患者疼痛指數(shù)有相關(guān)性。該研究為此后ctDNA與腫瘤之間相關(guān)研究奠定了基石。

ctDNA的定義為循環(huán)血液中所存在的腫瘤DNA片段。與cfDNA不同，ctDNA強調(diào)與腫瘤的相關(guān)性，即它來自腫瘤，且片段中含有腫瘤特異性的突變。健康人血液中存在cfDNA，但是一定沒有ctDNA；惡性腫瘤患者cfDNA載量明顯上升，其中大部分均為來自腫瘤釋放的ctDNA。其次二者檢測手段不同，cfDNA可以以一段穩(wěn)定的體細胞序列為探針，但ctDNA檢測必須運用腫瘤特異性突變做探針。限于目前對腫瘤基因組的認識不足，因此許多研究中使用cfDNA的水平替代ctDNA來檢測惡性腫瘤。

腫瘤患者血液中的循環(huán)DNA帶有腫瘤相關(guān)的基因和表觀基因型突變，這些突變與腫瘤的發(fā)生、進展和耐藥性相關(guān)。突變類型包括雜合性缺失、抑癌基因突變（如tp53基因）及原癌基因突變（如kras和braf基因）。其中kras基因突變見于10%~30%的子宮內(nèi)膜癌患者。p53基因突變也常見于子宮內(nèi)膜癌中，甚至與患者的預(yù)后有一定相關(guān)性。此外子宮內(nèi)膜癌中常伴有表觀遺傳學(xué)的改變，如甲基化異常。這些突變位點作為檢測靶點，是ctDNA檢測的基礎(chǔ)。cfDNA由基因組DNA和線粒體DNA構(gòu)成。同樣包含編碼DNA和非編碼DNA，其中非編碼DNA可以用來檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失、基因多態(tài)性、完整性等異常改變。

循環(huán)DNA的產(chǎn)生機制不甚明確，目前有許多假說與猜測。研究者推測血液中游離的核酸來自壞死和凋亡的腫瘤細胞。此外，ctDNA也可能來自于癌細胞的主動分泌。據(jù)估計，若腫瘤組織超過100g，則每天將會有約3.3%的腫瘤DNA釋放入血液。DNA碎片的大小介于70~200個堿基對不等，大者可達21kb。循環(huán)中腫瘤細胞或已轉(zhuǎn)移至遠處的轉(zhuǎn)移細胞也可能是ctDNA的來源之一。

腫瘤具有異質(zhì)性，一塊腫瘤組織所含細胞的基因組不盡相同。腫瘤進展過程中，腫瘤相關(guān)性的ctDNA和野生型（正常）cfDNA同時會被釋放入血，因此盡管來源于同一塊腫瘤組織的cfDNA其成分也千差萬別。cfDNA的血清水平同樣受到清除率、降解率和其他血液系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的濾過影響。核酸通過肝臟和腎臟代謝，其半衰期在15min~420min之間。值得注意的是，血清中ctDNA載量上升可見于多種狀況，除惡性腫瘤之外，良性腫瘤、炎癥、中風(fēng)、創(chuàng)傷、膿毒血癥等應(yīng)激狀況下也會上升，在進行檢測時應(yīng)注意鑒別。

ctDNA檢測與液體活檢

液體活檢指通過采集患者體液，包括血液及唾液、汗液等分泌物，進行無創(chuàng)的腫瘤檢測的方法。目前常見的檢測項目包括循環(huán)腫瘤細胞、ctDNA、循環(huán)腫瘤mRNA及腫瘤細胞來源的外泌體等。它們共同的特點是需要經(jīng)過采集體液、富集、通過特異性探針捕獲細胞/DNA/mRNA/外泌體、定量檢測的過程。ctDNA的檢測目前缺乏一個標準的手段，目前最常見的檢測方法為聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），具體又分為實時定量PCR、數(shù)字PCR等方法。但是整個檢測流程，包括采血、處理、標本儲存、制定正常值等問題都亟待規(guī)范。目前ctDNA檢測尚處試驗探索階段，不同研究應(yīng)用不同的平臺和方法，為試驗結(jié)果的解讀和比較帶來了困難。

ctDNA與子宮內(nèi)膜癌

理論上ctDNA檢測是一項精準技術(shù)，具有良好的發(fā)展前景，但由于目前腫瘤基因組的認識不足以及檢測手段的局限性，同樣關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的研究結(jié)果亦不盡人意。Tanaka等人比較了子宮內(nèi)膜癌患者與良性疾病及健康對照的血清cfDNA水平差異。共納入53例子宮內(nèi)膜癌患者，9例良性婦科疾病患者和15例健康對照。結(jié)果表明子宮內(nèi)膜癌患者cfDNA定量略高于良性病變患者，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義；患者術(shù)前和術(shù)后相比較，cfDNA水平差別也不具有統(tǒng)計學(xué)意義。該研究表明ctDNA定量在子宮內(nèi)膜癌篩查中的應(yīng)用具有局限性，作者推測同一患者不同時間點cfDNA水平的變化可能具有意義。Dobrzycka等人進行了一項研究，共納入109例初診子宮內(nèi)膜癌患者，結(jié)果20例（18%）患者血中檢出cfDNA，其中Ⅱ型內(nèi)膜癌患者檢出率較高，可達36.4%（8/22）；而I型內(nèi)膜癌中檢出率僅為13.8%（12/87）。作者因此認為cfDNA有作為Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌獨立血清預(yù)后因子的潛力，其聯(lián)合p53-Ab診斷子宮內(nèi)膜癌甚至指導(dǎo)治療。Pereira等人對子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌患者血清中的ctDNA進行較為全面的研究。共納入卵巢癌22例，子宮內(nèi)膜癌17例。結(jié)果提示，ctDNA對于子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌診斷的敏感性與CA125相似，但是特異性非常高，因此在特異性方面優(yōu)于CA125。對比手術(shù)前后ctDNA的水平，研究者觀察到術(shù)后ctDNA的消失與患者預(yù)后顯著相關(guān)。

綜合以上文獻，目前認為循環(huán)腫瘤DNA的檢測并不適用于子宮內(nèi)膜癌的早期篩查。值得一提的是，Dobrzycka等的研究提示我們ctDNA可能對Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌敏感性更強。這類特殊類型的子宮內(nèi)膜癌，如漿液性癌，其侵襲轉(zhuǎn)移能力強，早期即可發(fā)生盆腹腔轉(zhuǎn)移，若能通過ctDNA篩查，則臨床意義更大。子宮內(nèi)膜癌患者血清中同樣存在有異常甲基化DNA片段，可以作為檢測靶點，甲基化的異常在其他婦科腫瘤中均有研究，但是子宮內(nèi)膜癌相關(guān)研究甚少。究其原因，一方面由于子宮內(nèi)膜癌早期癥狀明確，健康人群無需進行常規(guī)篩查；另一方面通過宮腔灌洗液或子宮內(nèi)膜活檢的方法可以簡單、方便地獲得細胞學(xué)標本，對組織學(xué)標本DNA檢測較血清或血漿更為精確。

展望

ctDNA檢測僅通過采集患者外周血，即可獲得體內(nèi)腫瘤細胞的基因組信息，是一種突破性的革新技術(shù)。相較于傳統(tǒng)的內(nèi)膜活檢具有以下獨到的優(yōu)勢：（1）無創(chuàng)，避免了傳統(tǒng)方法為患者帶來的不適；（2）取樣全面，一次性采集體內(nèi)腫瘤細胞的全部信息，避免腫瘤異質(zhì)性帶來的取樣不全；（3）精準，直接獲得腫瘤基因組信息，同時用于指導(dǎo)后續(xù)靶向治療；（4）早期即可在血中檢出，甚至早于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)；（5）腫瘤分子分型是一種趨勢，最新的分型方法基于突變類型和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，將傳統(tǒng)的二分類法擴充為四類，而傳統(tǒng)的CA125、影像學(xué)檢查結(jié)果對新的分型沒有意義。未來我們可能必須要獲得腫瘤基因組信息才能開啟一系列精準治療方案，此時ctDNA檢測可能會成為診療過程中不可缺少的一部分。

盡管前景光明，但是ctDNA檢測作為一種新興技術(shù)，仍存有許多問題。首先這項技術(shù)只停留在實驗階段，缺乏統(tǒng)一的標準。如對于血樣采集、DNA分離、檢測手段等，不同試驗研究中異質(zhì)性非常大。其次，腫瘤的異質(zhì)性決定了其基因突變位點多而復(fù)雜，如何確定最優(yōu)的候選基因需要研究者們的大量的工作。最后，目前對于ctDNA的檢測手段仍不完善，組織學(xué)與血液學(xué)結(jié)果存在差異。因此短期內(nèi)想要在臨床中實現(xiàn)十分困難。

總之，ctDNA液體活檢技術(shù)在子宮內(nèi)膜癌中具有獨到的優(yōu)勢和很好的應(yīng)用前景。盡管目前的應(yīng)用較為局限，但是相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，會有更多新的檢測項目和手段被提出，其獨特的臨床價值會逐漸顯現(xiàn)。