真菌性腸炎

真菌性腸炎的檢查：

1.病原學(xué)檢查由于真菌廣泛分布于自然界，甚至空氣中也常有孢子飛揚(yáng)，采集糞標(biāo)本和檢查操作中，應(yīng)盡可能減少污染，標(biāo)本要新鮮。有些真菌傳染性很強(qiáng)如莢膜組織胞漿菌，應(yīng)注意安全防護(hù)，以免造成實(shí)驗(yàn)室人員感染。
(1)直接鏡檢標(biāo)本：以10%氫氧化鉀或生理鹽水制片，高倍鏡下發(fā)現(xiàn)大量菌絲和孢子有診斷意義。對(duì)于雙相型真菌，僅查到孢子可能是正常帶菌。真菌性腸炎的6種常見(jiàn)病原多數(shù)情況下直接鏡檢即可鑒定，但孢子、菌絲和其他背景物質(zhì)有時(shí)相互混淆，不易辨認(rèn)。
①菌絲和孢子：菌絲粗細(xì)一致，除毛霉菌外均有分隔，可見(jiàn)不同角度的分支，細(xì)胞質(zhì)均勻，內(nèi)含大小不等的顆粒。孢子多為圓形或卵圓形，多數(shù)大小一致，邊緣整齊，可見(jiàn)細(xì)胞構(gòu)造。
②細(xì)胞壁：在氫氧化鉀溶液處理的標(biāo)本中，細(xì)胞壁常變寬，連接成弧狀，類似菌絲，但無(wú)菌絲的構(gòu)造。
③石棉體：比菌絲更細(xì)，不分節(jié)，無(wú)菌絲顆粒。
④植物纖維：未消化的食物殘?jiān)?，邊緣不整，無(wú)分支。
⑤脂細(xì)胞：圓形，構(gòu)造模糊，無(wú)細(xì)胞壁。
⑥磷脂小球：大小不一，形狀不整，無(wú)細(xì)胞構(gòu)造。
⑦氫氧化鉀結(jié)晶：雪花樣或珊瑚狀，邊緣呈鋸齒形，折光性強(qiáng)。
⑧小水皰：圓形，透亮，無(wú)細(xì)胞構(gòu)造。
(2)染色鏡檢常用的染色方法：
①革蘭染色：適用于念珠菌，孢子、菌絲染成藍(lán)色，但著色不均。
②過(guò)碘酸錫夫染色(PA5)：真菌孢子、菌絲均染成紅色。
③丫啶橙染色：熒光顯微鏡下真菌孢子呈亮綠色。
④吉姆薩染色和瑞特染色：適用于莢膜組織胞漿菌，染色前用甲醇固定，油鏡下菌體染成紅色，較小一端有出芽，菌體周圍有一圈莢膜樣結(jié)構(gòu)，為此菌的細(xì)胞壁。通常菌體位于巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞內(nèi)，少數(shù)位于細(xì)胞外。
⑤乳酸酚棉藍(lán)染色：適用于各種真菌培養(yǎng)涂片，菌體染成藍(lán)色。
(3)真菌培養(yǎng)：糞標(biāo)本直接鏡檢通常不容易確定菌種，需參考糞培養(yǎng)結(jié)果，觀察菌落形態(tài)，再挑取菌落染色后鏡檢。常用沙保培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基。對(duì)于雙相型真菌還需在不同溫度下(25℃或37℃)分別培養(yǎng)，以便觀察其形態(tài)改變。
①大培養(yǎng)：是鑒別真菌的主要方法之一，可觀察菌落的生長(zhǎng)情況。根據(jù)菌落的生長(zhǎng)速度、形態(tài)、色澤等，初步判別菌種。
A.試管斜面：用白金環(huán)刺破瓊脂平面，分3點(diǎn)將標(biāo)本接種于試管斜面培養(yǎng)基上。此法不易污染，但菌落較小。
B.培養(yǎng)皿：分3點(diǎn)將標(biāo)本接種于平皿培養(yǎng)基中央，倒置后放恒溫箱中培養(yǎng)，每3天觀察1次菌落生長(zhǎng)情況。
②小培養(yǎng)：將大培養(yǎng)中生長(zhǎng)較好的菌落接種在玻片培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1～3天后，在顯微鏡下觀察菌體的特征。
A.點(diǎn)片法：先將少許培養(yǎng)基成形于載玻片中央，再將菌種接種于培養(yǎng)基邊緣。覆以蓋玻片，置于有U形管的玻璃平皿中，培養(yǎng)后于不同時(shí)間取出鏡下觀察或染色鏡檢。
B.壓片法：將菌種接種在試管斜面或平皿培養(yǎng)基上，覆一蓋玻片，以便菌體向蓋玻片上生長(zhǎng)，然后于適當(dāng)時(shí)間取出置于載玻片上鏡檢。
2.組織病理學(xué)檢查　有些真菌屬于人腸道內(nèi)正常菌群，如白念珠菌。且真菌污染問(wèn)題廣泛存在，所以糞標(biāo)本病原學(xué)檢查的診斷價(jià)值有限，有時(shí)需結(jié)合腸鏡活檢結(jié)果綜合判斷。
(1)曲菌感染的病理變化：具有診斷意義，包括：
①炎癥：急性滲出性炎癥。
②潰瘍形成：由于曲菌侵犯血管，引起血管破壞，出現(xiàn)血栓和組織壞死;潰瘍大小不一，形態(tài)各異，可深達(dá)肌層，底面粗糙不平，有膿性滲出。
③肉芽腫：由上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成，伴有中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞浸潤(rùn)。
④化膿性改變：黏膜下小膿腫形成，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，其中可見(jiàn)菌絲。
(2)病理切片中發(fā)現(xiàn)真菌孢子和菌絲，是侵襲性腸炎的直接證據(jù)，有肯定的診斷意義。染色方法包括：
①過(guò)碘酸錫夫染色：真菌呈紅色。
②烏洛托品銀染色：真菌呈黑色。
③丫啶橙熒光染色：真菌呈黃色或紅色熒光。
3.免疫學(xué)檢查
(1)真菌菌素皮膚試驗(yàn)：用念珠菌、曲菌、組織胞漿菌、副球孢子菌等真菌的菌素或菌苗，按不同的稀釋比例做皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，48h后出現(xiàn)直徑大于5mm硬結(jié)或紅斑為陽(yáng)性，對(duì)于診斷臨床癥狀不典型的患者，有參考價(jià)值。
(2)血清抗原檢測(cè)：病原真菌被人體吞噬細(xì)胞等處理降解后，細(xì)胞壁和細(xì)胞漿抗原游離于血循環(huán)中，未被清除者可經(jīng)酶免疫法(EIA)、間接血凝試驗(yàn)、免疫印跡法等檢測(cè)。加熱休克蛋白屬于真菌胞漿抗原。Walsh等對(duì)腫瘤并發(fā)侵襲型念珠菌病，于發(fā)病后24h內(nèi)檢測(cè)有50%陽(yáng)性，特異性高達(dá)96%。又如用ElA法檢測(cè)曲菌腸炎患者血清中的細(xì)胞壁抗原和能與刀豆素A結(jié)合的相關(guān)抗原，有早期診斷價(jià)值，定量檢測(cè)抗原水平達(dá)100μg/ml時(shí)，可對(duì)真菌培養(yǎng)陰性者做出確診。
(3)血清抗體檢測(cè)：補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對(duì)診斷組織胞漿菌腸炎有一定價(jià)值，可參考皮膚試驗(yàn)結(jié)果綜合判斷以排除假陽(yáng)性。間接熒光素標(biāo)記抗體定量試驗(yàn)可用于診斷念珠菌腸炎。此外，尚有對(duì)流免疫電泳、乳膠凝集試驗(yàn)、ELA等常用方法，以后者最為敏感。但對(duì)于艾滋病等伴有免疫功能抑制的患者，抗體檢測(cè)容易出現(xiàn)假陰性。
(4)猬集反應(yīng)(cumping reaction)：念珠菌病患者血清內(nèi)有一種猬集因子和抑制猬集現(xiàn)象的干擾物，前者可抑制由念珠菌在試管中的活力。血清猬集反應(yīng)在正常人普遍存在，但感染念珠菌后，由于干擾物增多，猬集現(xiàn)象被抑制。
4.動(dòng)物接種試驗(yàn) 對(duì)于糞標(biāo)本真菌培養(yǎng)的菌落，其致病性如何，可進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物接種加以鑒定。
(1)接種方法：刮取培養(yǎng)基上的菌落，研碎，加生理鹽水稍加震蕩，濾去菌絲，制成孢子混懸液，濃度為108/ml左右，注入動(dòng)物體內(nèi)。根據(jù)動(dòng)物的大小及接種途徑，劑量0.2～1.0ml不等，可反復(fù)多次接種以加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物的致病性。
(2)動(dòng)物的選擇與接種途徑：因菌種不同，對(duì)動(dòng)物的感染性也不同，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)膭?dòng)物和不同的接種途徑：
①白念珠菌：選用兔靜脈注射或小鼠腹腔注射。
②曲菌：選用兔、小雞靜脈或腹腔注射。
③毛霉菌：選用兔靜脈注射。
④組織胞漿菌：菌液加5%胃黏液素，選用大鼠或小鼠腹腔注射。
⑤副球孢子菌：選用豚鼠睪丸內(nèi)注射。
⑥地絲菌：對(duì)動(dòng)物不致病。
(3)動(dòng)物解剖：解剖前將動(dòng)物放入5%苯酚溶液中消毒，然后在無(wú)菌條件下檢查相應(yīng)組織、器官的病理改變，并取病灶材料作直接涂片和真菌培養(yǎng)。解剖后的動(dòng)物尸體應(yīng)火化，不可土埋，以免致病真菌擴(kuò)散。
利用氣相色譜法測(cè)定血清中真菌代謝產(chǎn)物或分解產(chǎn)物濃度，對(duì)診斷侵襲型真菌性腸炎有一定參考價(jià)值。如念珠菌胞壁上的甘露聚糖經(jīng)水解后產(chǎn)生甘露糖，其血清濃度在念珠菌菌血癥常大于800μg/ml，念珠菌腸炎在600～800μg/ml之間，正常人低于600 μg/ml。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展也為深部真菌病的診斷開辟了新的途徑。核配探針雜交和PCR技術(shù)，可測(cè)定真菌的特異性基因片段，敏感、快速，目前國(guó)內(nèi)外均已開展。如Buchman等報(bào)道，念珠菌羊毛固醇去甲基酶的編碼基因，為真菌特異性基因片段，通過(guò)PCR法檢測(cè)可用于臨床診斷深部真菌病。