罹患惡性腫瘤對于患者是一種獨特的心理體驗，絕大多數(shù)腫瘤病人承受不同程度的精神壓力，悲觀、恐懼、焦慮等情緒常伴隨腫瘤的診斷、手術、治療全過程。繼體溫、呼吸、心跳、血壓和疼痛之后，心理壓力及情緒異常被定義為腫瘤患者的“第六大生命體征”。大量流行病學的研究結果表明，患者心理及情緒因素對腫瘤的進展及患者的預后產(chǎn)生重要影響，然而其機制尚不清楚。軍事醫(yī)學科學院礎醫(yī)學研究所郭寧教授課題組最近發(fā)表在Oncogene雜志上的研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺及其重要受體β2腎上腺素能受體在乳腺癌靶向治療療效中的影響，為我們揭示心理壓力對腫瘤療效的影響的分子機制的一種可能，研究結果很有趣也很有意義。

　　β2腎上腺素能受體激活誘導Her2陽性乳腺癌細胞赫賽汀耐藥的分子機制研究

　　乳腺癌是一類嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，原癌基因Her2在20%-30%乳腺癌患者中過表達，靶向Her2的治療性抗體赫賽汀現(xiàn)為乳腺癌臨床治療的一線用藥，但耐藥成為制約其臨床療效的關鍵問題。首先赫賽汀單獨應用時反應率低（約12%-34%），表明多數(shù)患者對赫賽汀呈原發(fā)性耐藥，其次大多數(shù)赫賽汀初始治療有效的乳腺癌患者（約66%-88%）在用藥1年內(nèi)則可發(fā)生赫賽汀繼發(fā)性耐藥。迄今為止，赫賽汀原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥的機制仍不清楚。

　　腫瘤患者均承受不同程度的精神壓力而長期處于悲觀、恐懼、焦慮等不良應激狀態(tài)，負面情緒可能貫穿腫瘤診斷、手術、放化療全程。機體對于慢性心理應激刺激的應答主要是通過交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮和下丘腦-垂體-腎上腺軸激活來實現(xiàn)的。應激反應刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸及交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放兒茶酚胺，與廣泛存在于組織器官中的β腎上腺素能受體（β-AR）結合，觸發(fā)β-AR介導的信號級聯(lián)反應，導致cAMP合成、蛋白激酶磷酸化及轉錄因子激活，從而引發(fā)細胞生物學行為的改變。體外研究結果顯示，腎上腺素能信號可調(diào)控多種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的基因表達，影響腫瘤細胞的生物學行為，包括腫瘤細胞增殖、細胞外基質(zhì)侵襲、血管發(fā)生、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）激活及炎性細胞因子和趨化性細胞因子表達等。因此，慢性應激引起的體內(nèi)兒茶酚胺等神經(jīng)遞質(zhì)及神經(jīng)內(nèi)分泌激素持續(xù)、過度釋放，可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療過程中發(fā)揮重要的作用。

　　我們前期研究結果揭示，1）乳腺癌組織中兒茶酚胺的重要受體β2腎上腺素能受體（β2-AR）的表達水平顯著升高，β2-AR與Her2在乳腺癌組織中共表達，表達水平具有明顯的相關性；2）高表達Her2的乳腺癌細胞可通過激活ERK信號通路，促進兒茶酚胺合成酶的表達，誘導腫瘤細胞自分泌腎上腺素，實現(xiàn)腫瘤細胞β2-AR信號通路的自我激活。且該效應在Her家族配體Herregulin的刺激下會進一步增強；3）兒茶酚胺可通過活化STAT3，促進Her2轉錄，導致Her2表達水平升高及活化，過表達Her2亦可導致β2-AR的表達上調(diào)，二者在乳腺癌細胞中的表達構成正反饋調(diào)控環(huán)路；4）Her2過表達乳腺癌細胞在兒茶酚胺刺激下增殖活性明顯增強，提示β2-AR與Her2的交互作用可能產(chǎn)生了更強的增殖信號，從而不僅可能影響乳腺癌細胞的生物學行為，而且可能影響其對靶向Her2的抗腫瘤藥物的敏感性。更為有趣的是，兒茶酚胺誘導β2-AR信號通路活化產(chǎn)生的效應可能拮抗了多種已知的赫賽汀抗腫瘤機制。1）兒茶酚胺刺激Her2陽性乳腺癌細胞，激活了β2-AR介導的信號級聯(lián)反應，促進了腫瘤細胞的增殖。拮抗了赫賽汀抗腫瘤細胞增殖效應。2）β2-AR與Her2在乳腺癌細胞中可形成正反饋表達調(diào)控環(huán)路，活化了Her2下游重要促生存信號通路，增強促生存信號，由此拮抗了赫賽汀抑Her2下游信號通路活性的效應。3）兒茶酚胺誘導β2-AR活化可同時激活乳腺癌細胞內(nèi)兩個重要的轉錄因子（STAT3和AP-1），這兩個轉錄因子以協(xié)同調(diào)控的方式增強腫瘤細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，而該類分子的表達參與腫瘤血管生成，因而可能拮抗赫賽汀抑制血管生成效應?；谏鲜鲅芯堪l(fā)現(xiàn)，我們提出本次研究設想，即β2-AR介導的信號通路激活可能影響Her2陽性乳腺癌細胞對赫賽汀的反應性。首先我們收集了83例經(jīng)赫賽汀新輔助治療的Her2陽性乳腺癌患者的組織標本，應用β2-AR特異性抗體對其進行染色，根據(jù)染色強度將患者分為β2-AR高表達組和β2-AR低表達組，同時按治療后是否達到病理完全緩解（pCR）將患者分為pCR組和nopCR組，Wilcoxon秩和檢驗和Cochran-Armitage趨勢卡方檢驗結果均提示β2-AR表達水平與赫賽汀耐藥密切相關。β2-AR表達水平越高，赫賽汀的反應性越差，患者的預后越不好（Fig.1a-e）。

　　Fig.1

　　β2-AR表達水平與赫賽汀療效之間存在相關性。A，β2-AR免疫組化結果評分；B、C，Wilcoxon秩和檢驗結果；D，卡方檢驗分析結果；E，Cochran-Armitage趨勢卡方檢驗分析結果

　　我們已發(fā)表的研究論文揭示，乳腺癌細胞中β2-AR與Her2形成正反饋表達調(diào)控環(huán)路，兒茶酚胺刺激激活β2-AR信號，上調(diào)Her2分子的表達，活化PI3K-Akt和ERK信號通路，并最終產(chǎn)生更強的增殖信號。本次研究通過免疫印跡法在兩種高表達Her2的乳腺癌細胞（BT474和MCF-7/Her2）中再次驗證了兒茶酚胺刺激對Her2分子表達及其下游信號通路活性的激活效應，而且進一步發(fā)現(xiàn)β2-AR與赫賽汀聯(lián)用可顯著逆轉赫賽汀對Her2表達及其下游AKT/ERK信號的抑制效應，并最終拮抗赫賽汀抑腫瘤細胞增殖效應（Fig.2a-d）。體內(nèi)試驗的結果亦證實，赫賽汀單獨應用可顯著抑制移植瘤的增殖，而在兒茶酚胺存在的情況下，赫賽汀的抑瘤活性受到明顯的抑制（Fig.2e）

　　Fig.2

　　β2-AR激動劑在體內(nèi)外均可拮抗赫賽汀的抑增殖效應。A，β2-AR激動劑刺激BT474和MCF-7/Her2細胞檢測ERK及AKT信號通路活化；B，β2-AR激動劑刺激BT474和MCF-7/Her2細胞檢測Her2表達及其磷酸化；C，β2-AR激動劑刺激BT474和MCF-7/Her2細胞檢測Her2表達、活化及其下游ERK、AKT的磷酸化；D，同時用ISO(異丙腎上腺素)和赫賽汀處理乳腺癌細胞，ISO可顯著拮抗赫賽汀的抑增殖效應，且具有量效關系

　　miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子非編碼RNA，通過調(diào)控其下游靶基因的表達，參與多種病理生理過程，是潛在的藥靶和生物標記物。我們通過qPCR的方法檢測到兒茶酚胺的刺激可以在兩種Her2陽性的乳腺癌細胞中上調(diào)miR-21的表達（Fig.3a）。已有研究表明PI3K-Akt信號通路的重要負調(diào)控分子Pten是miR-21的下游靶基因。由此我們推斷，兒茶酚胺的刺激通過上調(diào)miR-21表達，抑制Pten表達，最終導致PI3K-Akt信號通路的異?；罨?。WesternBlot的結果驗證了這一設想，我們發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺的刺激確實可以顯著下調(diào)Pten的表達，而過表達miR-21inhibitor，抑制miR-21的表達后，Pten的表達得以恢復（Fig.3b-c）。

　　Fig.3

　　β2-AR活化上調(diào)miR-21表達，抑制Pten表達。A，β2-AR激動劑刺激MCF-7/Her2細胞檢測pre-miR-21和mature-miR-21表達。β2-AR激動劑刺激BT474細胞檢測mature-miR-21表達；B，β2-AR激動劑刺激MCF-7/Her2細胞檢測Pten表達。β2-AR激動劑刺激miR-21inhibitor過表達的MCF-7/Her2細胞檢測Pten表達；C，β2-AR激動劑刺激miR-21inhibitor過表達的BT474細胞檢測Pten表達

　　通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，兒茶酚胺刺激活化β2-AR信號可以在兩種Her2陽性乳腺癌細胞中顯著抑制miR-199a/b-3p的表達（Fig.4a）。已有文獻證實mTOR是miR-199a/b-3p的靶基因，因此我們提出假設：即β2-AR信號活化可能通過抑制miR-199a/b-3p上調(diào)其靶分子mTOR表達，造成PI3K-Akt-mTOR信號通路異常激活，導致乳腺癌細胞對赫賽汀的反應性降低，表現(xiàn)為赫賽汀耐藥。WesternBlot結果初步驗證了這一假設，我們發(fā)現(xiàn)兩種高表達Her2的乳腺癌細胞中，兒茶酚胺刺激均可顯著增強mTOR的表達及活化，但通過轉染miR-199a/b-3pmimics，恢復miR-199a/b-3p表達后，mTOR的誘導表達上調(diào)受到明顯抑制。（Fig.4b-c）。體外增殖實驗的結果亦證實，與對照細胞相比，感染miR-199a-2慢病毒（購自上海吉凱基因公司）后的乳腺癌細胞對赫賽汀更為敏感，赫賽汀的抑增殖效應更明顯（Fig.4d）。

　　Fig.4

　　β2-AR活化抑制miR-199a/b-3p表達，誘導mTOR表達、活化。A，β2-AR激動劑刺激MDA-453和MCF-7/Her2細胞檢測miR-199a/b-3p表達；B，β2-AR激動劑刺激BT474和MCF-7/Her2細胞檢測mTOR表達、活化；C，β2-AR激動劑刺激過表達miR-199a/b-3pmimics的BT474和MCF-7/Her2細胞檢測mTOR表達；D，在乳腺癌細胞中使用慢病毒過表達miR-199a-2可顯著增強拮抗赫賽汀的抑增殖效應

　　最近，有研究者發(fā)現(xiàn)MUC-1蛋白與赫賽汀耐藥的發(fā)生關系密切，但具體的機制不清楚。MUC-1是一個高分子量，高糖基化的跨膜黏蛋白，是重要的腫瘤生物學標志物。其胞內(nèi)域存在一段高度保守的序列可以被多種酪氨酸激酶磷酸化，在腫瘤信號轉導中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)MUC-1是STAT3的下游信號分子，可與STAT3形成正反饋調(diào)控環(huán)路。而且最近一篇關于非小細胞肺癌的研究揭示MUC-1表達異常增強可以激活PI3K-Akt信號通路。由此我們有理由推斷，兒茶酚胺刺激誘導β2-AR活化，激活乳腺癌細胞內(nèi)STAT3信號分子，上調(diào)MUC-1表達，進而造成PI3K-Akt信號通路活性異常升高。首先，我們在兒茶酚胺誘導的兩種Her2陽性乳腺癌細胞中檢測了上述信號分子的表達、活化，結果顯示：兒茶酚胺刺激可以顯著上調(diào)STAT3和AKT的磷酸化水平，誘導MUC-1表達增強（Fig.5a）。繼而，我們運用STAT3特異性siRNA敲低STAT3表達，發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺刺激誘導MUC-1表達上調(diào)的效應被顯著抑制，提示兒茶酚胺刺激通過活化STAT3上調(diào)MUC-1的表達水平（Fig.5b）。同樣當我們用MUC-1的特異性siRNA敲低MUC-1表達后，兒茶酚胺刺激不能再顯著上調(diào)AKT的磷酸化水平，提示兒茶酚胺刺激β2-AR活化，通過增強MUC-1的表達影響AKT信號通路活性（Fig.5c）。

　　Fig.5

　　兒茶酚胺刺激激活STAT3，上調(diào)MUC-1表達，活化AKT信號。A，β2-AR激動劑刺激BT474和MCF-7/Her2細胞檢測MUC-1表達，STAT3和AKT磷酸化；B，STAT3siRNA敲低STAT3表達檢測MUC-1的表達水平；C，MUC-1siRNA敲低MUC-1表達檢測AKT的表達、活化

　　上述研究結果提示我們：β2-AR及其信號可能在赫賽汀耐藥過程中發(fā)揮關鍵作用:（1）兒茶酚胺刺激活化β2-AR信號，上調(diào)miR-21表達，抑制PI3K-Akt信號通路重要負調(diào)控分子Pten的表達，；（2）β2-AR信號活化激活STAT3信號通路，上調(diào)MUC-1表達，造成AKT磷酸化水平異常升高；（3）β2-AR信號活化抑制miR-199a/b-3p表達，上調(diào)靶分子mTOR表達水平（Fig.6）。綜上所述，兒茶酚胺刺激激活β2-AR信號，通過協(xié)同調(diào)控多個關鍵信號分子最終導致PI3K/Akt/mTOR信號通路的異?；罨T導乳腺癌細胞對赫賽汀產(chǎn)生抗性。由此可見，β2-AR是誘導赫賽汀耐藥發(fā)生的重要節(jié)點分子，可將其作為預測赫賽汀反應性的靶標分子，更重要的是調(diào)控該分子的活性可能成為逆轉赫賽汀耐藥的可行性策略。

　　Fig.6

　　赫賽汀發(fā)揮抑瘤效應及β2-AR信號活化誘導乳腺癌細胞赫賽汀耐藥分子機制示意圖

　　為此，我們開展了以下研究：首先我們對94例接受過赫賽汀治療的Her2陽性轉移性乳腺癌患者的臨床資料進行了回顧性分析，根據(jù)是否服用β-AR拮抗劑將患者分為赫賽汀治療組（63例）和赫賽汀+β-AR拮抗劑治療組（31例）。統(tǒng)計分析結果顯示，赫賽汀+β-AR拮抗劑治療組的疾病無進展生存期（PFS）顯著長于赫賽汀治療組（Fig.7a）。為了進一步驗證上述研究結果，我們構建了高表達Her2的乳腺癌細胞（MCF-7/Her2）的裸鼠移植瘤模型，用赫賽汀、普納洛爾或普納洛爾+赫賽汀處理荷瘤鼠，發(fā)現(xiàn)普納洛爾可顯著增強赫賽汀的抑瘤活性（Fig.7b）。同時我們收集了上述動物實驗的移植瘤組織標本，應用細胞增殖標記物Ki67和血管內(nèi)皮細胞標記物CD31的特異性抗體進行免疫組化染色，并對陽性細胞比例和染色強度進行量化分析。結果顯示，普納洛爾與赫賽汀聯(lián)用可顯著降低腫瘤細胞的增殖活性，抑制腫瘤新生血管生成（Fig.7c-d）。

　　Fig.7

　　β-AR拮抗劑與赫賽汀聯(lián)用可改善患者預后，增強赫賽汀體內(nèi)抗增殖效應和抑制血管生成效應。A，Kaplan-Meier分析口服β-AR拮抗劑對赫賽汀治療患者PFS的影響；B，β-AR拮抗劑與赫賽汀聯(lián)合處理荷瘤小鼠檢測移植瘤體積的動態(tài)變化；C，應用Ki67抗體對上述動物實驗的瘤組織進行免疫組化染色及量化分析的結果；D,應用CD31抗體對上述動物實驗的瘤組織進行免疫組化染色及量化分析的結果

　　本項研究揭示了赫賽汀耐藥的分子機制、鑒定了赫賽汀抗性相關靶點，同時為逆轉赫賽汀耐藥策略的建立提供了理論依據(jù)并進行了初步探索，對于乳腺癌新型治療方案的建立、改善乳腺癌患者的預后具有重要的臨床意義。